大蒜内生巨大芽孢杆菌对邻苯二甲酸酯的共代谢降解特性及代谢途径分析

肖霞霞　杨云　马丽雅　冯发运　葛静　李勇　王亚　余向阳　马桂珍

摘要： 土壤鄰苯二甲酸酯（PAE）污染对生态环境和农产品安全均构成威胁。为实现PAE污染土壤的生物修复，明确共代谢基质对微生物降解PAE的影响机制，从PAE污染的大蒜中筛选获得能降解PAE的内生菌。通过生理生化特征和16S rRNA基因测序对其种属进行了鉴定，并研究了内生菌对6种PAE的共代谢降解特性，优化了共代谢降解条件，初步探索了共代谢条件下内生菌对PAE的降解代谢途径。结果表明：从大蒜中共筛选出3株能降解PAE的内生菌DGB-1、DGB-3和DGB-8，经鉴定3者皆为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。3株菌株均能以6种PAE为碳源生长，但处理3 d后PAE的降解率仅0.89%～10.40%，降解能力较弱。添加D-纤维二糖为共代谢基质后，3株菌株对6种PAE的降解率均显著提升，其中菌株DGB-1和DGB-3处理3 d后能完全降解20 mg/L质量浓度的邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）。以DGB-1为供试菌株，发现吐温80添加量、碳源种类、碳源浓度和接菌量对6种PAE的降解率均有显著影响，最佳降解条件为吐温80添加量0.025%，碳源为D-纤维二糖、浓度为10 mmol/L，接种菌液OD₆₀₀为0.2。最佳降解条件下，当6种PAE质量浓度为50 mg/L时，邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、DBP、BBP、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）和邻苯二甲酸二辛酯（DnOP）在MSM培养基中的降解半衰期分别为9.01 d、2.27 d、2.13 d、1.99 d、7.84 d和6.72 d。菌株DGB-1不携带质粒，其PAE降解基因位于该菌染色体上；菌株DGB-1可通过水解作用完成对DBP、DEHP和DnOP的第一步降解，但水解作用均较弱；菌株DGB-1对6种PAE的降解代谢需要其细胞膜上的呼吸链系统参与，氧化还原反应增强可显著促进菌株DGB-1对6种PAE的降解。本研究为进一步利用内生菌进行PAE污染土壤的生物修复提供理论依据。

关键词： 内生菌；共代谢；邻苯二甲酸酯；降解途径

中图分类号： Q939.9 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2023）01-0106-12

Co-metabolic degradation characteristics and metabolic pathways analysis of phthalic acid esters by endophytic Bacillus megaterium in garlic

XIAO Xia-xia^1，2， YANG Yun^1，2， MA Li-ya²， FENG Fa-yun²， GE Jing^2，3， LI Yong²， WANG Ya^2，3， YU Xiang-yang^2，3， MA Gui-zhen¹

（1.School of Food Science and Engineering， Jiangsu Ocean University， Lianyungang 222005， China;2.Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;3.School of the Environment and Safety Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China）

Abstract： Soil phthalic acid esters （PAEs） pollution is a threat to the ecological environment and the safety of agricultural products. In order to realize the bioremediation of PAEs contaminated soil and clarify the influence mechanism of co-metabolic matrix on the degradation of PAEs by microorganisms， endophytic bacteria capable of degrading PAEs were screened from PAEs contaminated garlic. The strains were identified by physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequencing， and the co-metabolic degradation characteristics of six PAEs by endophytes were studied. The co-metabolic degradation conditions were optimized， and the degradation metabolic pathway of PAEs by endophytes under co-metabolic condition was preliminarily explored.The results showed that three endophytic bacteria DGB-1， DGB-3 and DGB-8 capable of degrading PAEs were screened from garlic， and they were identified as Bacillus megaterium. Although three strains of bacteria demonstrated the ability to utilize six different types of PAEs as carbon sources for growth， their capacity for PAEs degradation was limited. After a three-day treatment， degradation rates ranged from 0.89% to 10.40%. After adding D-cellobiose as co-metabolism substrate， the degradation rates of six PAEs by the three strains were significantly improved. Among them， DGB-1 and DGB-3 strains could completely degrade 20mg/L dibutyl phthalate （DBP） and butyl benzyl phthalate （BBP） after three days of treatment. Using DGB-1 as test strain， it was found that the addition amount of Tween 80， carbon source type， carbon source concentration and inoculation dose had significant effects on the degradation rates of six PAEs. The optimal degradation conditions were as follows： the addition amount of Tween 80 was 0.025%， the carbon source was D-cellobiose， the concentration was 10 mmol/L， and OD₆₀₀value of bacterial solution was 0.2. Under the optimal degradation conditions， when the initial concentrations of six PAEs were 50 mg/L， the degradation half-lives of dimethyl phthalate （DMP）， diethyl phthalate （DEP）， DBP， BBP， di-（2-ethylhexyl） phthalate （DEHP） and di-n-octyl phthalate （DnOP） in inorganic salt medium were 9.01 d， 2.27 d， 2.13 d， 1.99 d， 7.84 d and 6.72 d， respectively. The strain DGB-1 did not carry a plasmid， and its PAEs degradation genes were located on the chromosome. DGB-1 could complete the first step degradation of DBP， DEHP and DnOP through hydrolysis， but the hydrolysis reactions were weak. The degradation of six PAEs by the strain DGB-1 required the participation of the respiratory chain system on the cell membrane. The enhanced redox reaction could significantly promote the degradation of six PAEs by the strain DGB-1. This study provides a theoretical basis for further use of endophytic bacteria for bioremediation of PAEs contaminated soil.

Key words： endophytic bacteria;co-metabolism;phthalic acid esters;degradation pathways

邻苯二甲酸酯（PAE）常作为增塑剂应用于农用地膜、棚膜等塑料制品的生产中，塑料产品中PAE含量约占总质量的10%～60%^[1]。PAE在合成材料中常以非化学共价键形式存在^[2]，容易被释放到大气、水体等环境介质中，并最终造成耕地土壤PAE污染^[3]。中国设施大棚土壤中PAE污染状况不容乐观，珠三角、长三角、环渤海等地区的调查结果显示，中国农田土壤中的主要PAE污染种类为邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP），平均含量高达9.23 mg/kg和11.00 mg/kg^[4]，远高于美国环保局制定的土壤PAE控制标准^[5]。PAE具有较强的生殖毒性和“三致”效应^[6]，土壤PAE污染不但对生态环境和农产品安全构成严重威胁，还可通过食物链积累放大进一步增加人体PAE暴露风险。因此，如何实现耕地土壤中PAE的高效去除已成为生态环境领域的研究热点和难点。

在土壤PAE治理技术中，物理修复工程量大、成本昂贵；化学修复效率高、降解谱广，但降低地力并增加修复成本；植物修复效率低、周期长^[6]。利用微生物修复土壤无二次污染，颇具优势，在降解土壤PAE中具有较好的应用潜力^[7]。国内外针对PAE降解菌的分离筛选及功能研究已开展多年，目前已有包括假单胞菌（Pseudomonas sp.）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）在内的超过80个PAE降解菌得到了详细的研究报道^[6，8-9]。但这些 PAE降解菌主要从水体、土壤及污泥等环境介质中分离获得，而从植物体内分离筛选具有降解PAE功能内生菌的报道较少^[10]。在植物根际接种内生菌不但显著促进了土壤中农药、多环芳烃等有机污染物降解，也明显加速了植物体内有机污染物降解速率^[11-13]。因此，利用植物内生菌同时去除耕地土壤和作物体内的PAE具有重要应用潜力，对于PAE污染土壤的修复和降低人体PAE暴露风险具有十分重要的意义^[10]。

多数PAE降解菌能以一种或多种PAE为碳源进行生长代谢^[8]。然而，自然环境中碳源种类繁多，降解菌对PAE的代谢途径、降解速率等特征可能因其他碳源存在而发生显著改变^[14]。此外，当土壤中污染物浓度较低时，微生物生长代谢所需的生长基质不足，微生物可能利用其他生长基质以提供生命活动所需的碳源和能源^[15]，这些碳源物质可提高土壤微生物活性和相关降解酶活性，从而加速污染物的共代谢降解^[16]。因此，开展微生物对PAE的共代谢降解研究，对于强化功能细菌对PAE污染土壤的修复作用有重要的理论和现实意义。

本实验室前期研究发现，大蒜及其产地土壤中存在PAE污染风险。其中，大蒜中的主要PAE污染种类为DBP，大蒜产地土壤中主要PAE检出种类为DMP（邻苯二甲酸二甲酯）、DEP（邻苯二甲酸二乙酯）、DBP和DEHP等^[17]。基于此，本研究从PAE污染大蒜中筛选获得具有降解PAE功能的内生菌，通过生理生化试验、结合16S rRNA基因测序对内生菌进行种属鉴定，考察了不同内生菌对PAE的共代谢降解特性，优化了共代谢降解条件，初步探索了内生菌对中国土壤中主要PAE污染类型的降解代谢途径，分析了共代谢底物对PAE降解途径的影响。研究结果可以丰富內生菌强化PAE降解代谢理论，为进一步利用内生菌进行PAE污染土壤的生物修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 主要仪器 气相色谱仪（岛津Nexis GC-2030，日本岛津公司产品）、扫描电子显微镜（蔡司ZEISS EVO-LS10，德国蔡司集团产品）、离子溅射仪（CRESSINGTON 108auto，英国cressington公司产品）、临界点干燥仪（Quorum K850，英国Quorum公司产品）、全波长酶标仪（Biotek EPOCH2，美国BioTek公司产品）、超纯水机（Millipore，美国 Merck Millipore 公司产品）、数显型多管式旋涡混合仪（DMT-2500，郑州明天仪器设备有限公司产品）、超声波清洗器（KQ-500DV，昆山超声仪器有限公司产品）、高通量样品磨样机（CK-2000，北京托摩根生物有限公司产品）、高速冷冻离心机（中科中佳KDC-220HR，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品）。

1.1.2 化学试剂 99.0% DMP、99.5% DEP和99.0% DEHP，购自上海麦克林生化科技股份有限公司；99.5%DBP购自上海凌峰化学试剂有限公司；98%邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）和98%邻苯二甲酸二辛酯（DnOP），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

6种PAE（DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP）混合标准液：用天平称取6种PAE各1.0 g，用色谱级乙腈将其定容至100 ml，配置成6种PAE质量浓度分别为10 000 mg/L的标准液。

色谱级正己烷购自北京迈瑞达科技有限公司；色谱纯乙腈购自德国Merck公司；硫酸锰购自国药集团化学试剂有限公司；硫酸镍购自成都科龙化工试剂厂；2.4-二硝基苯酚（DNP）购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培养基 无机盐培养基（MSM）： MgSO₄·7H₂O 0.40 g、 K₂HPO₄0.20 g、 （NH₄）₂SO₄0.20 g、 CaSO₄0.08 g、微量元素溶液1 ml，去离子水定容至1 L，调节pH值为7.2±0.2，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min备用。微量元素溶液参考Ma等^[18]的方法配制。

R2A培养基：胰蛋白胨0.25 g、酸水解酪蛋白0.50 g、酵母浸粉0.50 g、可溶性淀粉0.50 g、磷酸氢二钾0.30 g、硫酸镁0.10 g、丙酮酸钠0.30 g、蛋白胨0.25 g、葡萄糖0.50 g，去离子水定容至1 L，调节pH值为7.2±0.2。

LB液体培养基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g，去离子水定容至1 L，调节pH值为7.0±0.2，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min备用。固体培养基分别在上述液体培养基中加琼脂15 g，灭菌后备用。

20 mmol/L PBS缓冲液：NaH₂PO₄·2H₂O 0.592 8 g、Na₂HPO₄·12H₂O 5.799 6 g，超纯水定容至1 L，调节pH值为7.4。

1.2 PAE降解菌的分离筛选、纯化与鉴定

1.2.1 菌株的分离筛选与纯化 供试大蒜（Alliumstivum L.）品种为大青稞，采集自江苏省农业科学院蔬菜试验田。该试验田长期用于PAE污染修复试验，PAE污染质量分数约80mg/kg。待大蒜生长至鳞茎膨大期，随机采集5株大蒜苗带回实验室，自来水清洗后，参考冯发运等^[19]的方法进行茎叶部分表面消毒。用无菌剪刀將消毒后的大蒜茎叶样品剪成2～3 cm小段，取4段样品置于10 ml灭菌的塑料离心管中，添加1 ml无菌水和2颗灭菌的氧化锆陶瓷珠，利用高通量样品磨样机700 r/min研磨5 min。取研磨液100 μl转入100 ml的LB培养液中，30 ℃、180 r/min摇床振荡培养12 h，5 000 r/min离心5 min收集菌体， MSM清洗3次，将菌体重悬于MSM培养液中，取100 μl菌悬液均匀涂布于MSM固体培养基，该培养基含6种质量浓度均为20 mg/L的PAE。30 ℃条件下培养48 h后，挑取单菌落在以PAE为碳源的MSM固体培养基上划线，对目标菌株进行分离纯化。重复操作5次后，挑选能以PAE为碳源生长的菌株，转入20%甘油中-80 ℃保藏。

1.2.2 菌株鉴定 将保藏的内生菌转接至LB培养液中，30 ℃条件下培养24 h，获得活化菌株。利用革兰氏染色法对细菌进行分类。

氨苄青霉素抗性：将内生菌接种于氨苄青霉素终质量浓度为50 mg/L的LB培养液中，30 ℃、180 r/min摇床培养24 h，观察细菌生长情况。

菌落形态：将活化的菌株在LB培养基上划线，置于30 ℃的恒温培养箱中培养24 h，待菌落形成后，观察并记录其形态、大小、颜色。

细菌形态：内生菌在LB培养液中30 ℃、180 r/min振荡培养12 h，离心收集菌体，20 mmol/L的PBS缓冲液清洗菌体3次，每次10 min。通过光学显微镜初步观察菌株的形态特征。然后，向菌体中加入终体积分数2.5%的戊二醛，混匀后室温下浸泡12 h，8 000 r/min离心5 min，弃上清液收集菌体，用酒精进行梯度洗脱，最后用100%酒精浸泡3次，每次30 min，利用扫描电子显微镜进一步观察菌株的形态特征。

细菌16S rRNA基因测序委托北京擎科生物科技有限公司完成。将获得的菌株16S rRNA序列在NCBI中进行BLAST分析，与GenBank数据库中的基因序列进行同源性比较。利用MEGA7.0软件采用邻位连接法（Neighbour Joining）绘制系统发育树。

1.3 菌株生长曲线的测定

将筛选出的菌株挑取单菌落接种于50 ml LB液体培养基中，在30 ℃、180 r/min下振荡培养30 h，获得种子液，用灭菌的LB培养液调节种子液细菌含量，使其600 nm处吸光值（OD₆₀₀）为1.0。将种子液取1ml接种于100 ml LB培养基中，每隔2 h测定1次OD₆₀₀值，连续测定30 h，以OD₆₀₀为纵坐标，时间为横坐标，绘制菌株生长曲线。

1.4 菌株对PAE的降解试验

1.4.1 共代谢降解试验 以筛选的菌株为供试菌株，以D-纤维二糖为生长基质、PAE为共代谢底物，开展共代谢降解试验。将筛选得到的菌株分别接种于LB液体培养基中，摇床培养14 h，离心收获菌体，MSM清洗三遍。取197.6 ml MSM液体培养基，依次添加10%吐温80（助溶剂）2 ml^[20]、10 mg/ml的6种PAE混合标准液0.4 ml，将其充分混匀后取20 ml分装于玻璃锥形瓶中，作为未接种菌液样品的对照组（CK），将清洗好的菌株重悬于剩余MSM培养液中，调整培养液初始OD₆₀₀为0.1，分装于玻璃锥形瓶中，设置加D-纤维二糖和不加D-纤维二糖两个处理。加糖浓度为10 mmol/L。将玻璃锥形瓶密封后于180 r/min、30℃摇床中培养3 d，取样检测MSM培养基中PAE质量浓度。每处理3次重复。

1.4.2 共代谢降解条件优化 选择降解能力强，且具有氨苄抗性的菌株开展共代谢降解条件优化试验。以吐温80添加量0.1%、10 mmol/L的D-纤维二糖、培养液初始OD₆₀₀0.1为初始值，开展吐温80添加量（0.006%、0.012%、0.025%、0.050%和0.100%），碳源种类（D-葡萄糖、D-果糖、D-纤维二糖、蔗糖和麦芽糖），碳源添加量（1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和50 mmol/L），细菌接种量（OD₆₀₀为0.05、0.10、0.20、0.30、0.40和0.50）对菌株生长及PAE降解的单因素影响试验，依次确定最佳吐温80添加量、最佳碳源种类、最佳碳源添加量、最佳初始接菌量。试验步骤及其他试验条件参考方法1.4.1，以不接菌液处理为对照，每组3次重复。

在最优条件下，进一步研究了菌株对不同质量浓度PAE（1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L和50 mg/L）的降解能力。分别在1 d、2 d、3 d、5 d和7 d取样测定菌株含量（OD₆₀₀）和MSM培养液中PAE残留量，并计算PAE降解率和半衰期^[21]。

式中：C₀为初始PAE质量浓度（mg/L）；C_t为t时间的PAE质量浓度（mg/L）；k为降解速率常数（d^-1）；t₁/2为半衰期（d）。

1.5 PAE降解菌代谢途径分析

1.5.1 细菌质粒DNA的提取 将筛选获得的菌株DGB-1转接于LB液体培养基中，30 ℃，180 r/min培养14 h，取2 ml菌液，根据AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取质粒，菌块中添加100 mg/ml的溶菌酶10 μl，供试菌株设置2个重复，枯草芽孢杆菌菌株W34为对照（该菌确认含有质粒）。取8 μl质粒，加入2 μl的5×Loading buffer，混匀，在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电压为130 V。通过凝胶成像系统进行观察，与Marker比较确定质粒大小。

1.5.2 胞内粗酶液对6种PAE的降解 胞内粗酶液制备：取10%的吐温80 0.4 ml分别加入159.6 ml MSM和R2A培养基中，得到吐温80含量为0.025%的MSM培养基和R2A培养基。将DGB-1接种于200 ml的LB中，30 ℃、180 r/min培养14 h。离心收获菌体，MSM培养液清洗3遍，分别重悬于20 ml R2A和MSM培养基中，调整菌液含菌量，使得初始OD₆₀₀为0.1。设置加菌、菌+糖、菌+PAE、菌+糖+PAE 4個处理，加糖处理D-纤维二糖浓度为10 mmol/L，加PAE处理6种PAE处理质量浓度均为20 mg/L。30℃、180 r/min摇床振荡培养3 d，离心收获菌体，20 mmol/L PBS清洗3次，置于-20 ℃冰箱冷冻2 h后，取出菌体于灭菌研钵中，依次加入液氮和20 mmol/L的PBS缓冲液进行研磨，研磨液（粗酶液）转入5 ml容量瓶中并用PBS缓冲液定容后，置于冰浴中保存备用。

PAE体外降解试验：取1.98 ml粗酶液，转入10 ml玻璃试管中，添加20 μl 1 000mg/L的6种PAE标液（溶剂为乙腈），使PAE终质量浓度为10 mg/L，用无菌橡胶塞密封后，置于37 ℃培养箱中反应4 h后，向试管中添加2 ml正己烷提取PAE，利用气相色谱法（GC）分析粗酶液中PAE含量。

1.5.3 DNP（2，4-二硝基苯酚）、Mn²⁺和Ni²⁺对6种PAE降解的影响 取10%吐温80 0.4 ml、10 g/L的6种PAE混合液0.32 ml加入159.28 ml的无机盐培养基中，得到吐温80含量0.025%、PAE含量20mg/L的无机盐培养基。将菌株DGB-1接种于LB培养基，30 ℃、180 r/min下培养14 h，菌液离心弃上清液后获得菌体，MSM培养基清洗3次，将清洗后的菌体重悬于上述无机盐培养基中，调整细菌含量使得培养基初始OD₆₀₀为0.2。设置2组试验，第1组设置4个不同的处理，分别为不加糖不加DNP（-糖-DNP）、不加糖加DNP（-糖+DNP）、加糖不加DNP（+糖-DNP）和加糖加DNP（+糖+DNP）。其中，DNP终浓度为0.5 mmol/L，D-纤维二糖终浓度为10 mmol/L；第2组设置5个不同的处理，分别为加糖（+糖）、加糖加0.1 mmol/L Mn²⁺（+糖+0.1 mmol/L Mn²⁺）、加糖加1.0 mmol/L Mn²⁺（+糖+1.0 mmol/L Mn²⁺）、加糖加0.1 mmol/L Ni²⁺（+糖+0.1 mmol/L Ni²⁺）、加糖加1.0 mmol/L Ni²⁺（+糖+1.0 mmol/L Ni²⁺），D-纤维二糖终浓度为10 mmol/L。以不加细菌而加入等体积灭菌生理盐水的处理为空白对照，每处理3次重复，摇床中振荡培养，3 d后取样测定OD₆₀₀、提取MSM培养基中的PAE，并利用GC法测定PAE含量。

1.6 样品中PAE提取及检测分析

MSM培养基中PAE提取：参考Li等^[22]的提取方法稍加改进，移液器移取2 ml MSM培养基，移入10 ml玻璃管中，添加2 ml正己烷，多管式旋涡混合仪2 000 r/min涡旋2次，每次5 min，超声提取2 min，离心5 min后取上层有机相，利用气相色谱仪分析6种PAE含量。

采用GC法分析样品中PAE含量，仪器色谱工作条件如下：色谱柱为SH-Rtx-5（30.00 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氮气，辅助气体为高纯氢气 和普通空气，色谱柱流量1.21 ml/min，分流比2.0，进样量1.0 μl，进样口温度280 ℃。柱箱升温程序：初始温度120 ℃，保持1 min，以20 ℃/min速率升温至220 ℃，以5 ℃/min速率升温至235 ℃，以10 ℃/min速率升温至245 ℃，以5 ℃/min速率升温至255 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min速率升温至275 ℃，保持2 min。

1.7 数据处理

采用Excel 2016和Origin 2021软件制图。采用SPSS 22.0进行数据统计分析，不同试验组间差异性比较采用单因素方差分析或Tukeys多重比较法进行显著性检验。

2 结果与讨论

2.1 PAE降解菌的分离与鉴定

通过多次分离纯化后，获得3株可以PAE为碳源生长的植物内生细菌，分别命名为DGB-1、DGB-3和DGB-8。革兰氏染色后3株菌株均呈现红色。氨苄青霉素抗性试验结果显示，DGB-1和DGB-8可耐受50 mg/L的氨苄青霉素，但DGB-3不具有氨苄青霉素耐受性。3株菌株的菌落均为圆形、乳白色、不透明，其中DGB-1、DGB-3菌落边缘整齐（图1a和图1b），而DGB-8菌落边缘呈锯齿状（图1c）。

在光学显微镜下，3株菌株均为长杆状（图1d～图1f）；扫描电镜结果进一步证明3株菌株为杆状细菌，其中DGB-1和DGB-3形态较为类似，呈短链排列（图1g和图1h），而DGB-8则呈长链排列（图1i）。将3株细菌的16S rRNA基因序列与NCBI数据库中的序列进行比对，并通过邻接法构建系统发生树。结果表明，3株菌株与巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）相似度最高，其中DGB-1和DGB-3的亲缘关系较近，DGB-8与上述2株菌株亲缘关系相对较远，而与巨大芽孢杆菌EGI278的亲缘关系更为接近。DGB-1、DGB-3和DGB-8与同样能利用DMP、DEP、DBP、DEHP和DnOP等多种PAE为碳源生长的美人蕉内生巨大芽孢杆菌YJB3^[10]的亲缘关系相对较远（图2）。基于3株菌株的生理生化特征和16S rRNA基因测序鉴定结果，DGB-1、DGB-3和DGB-8均鉴定为巨大芽孢杆菌。

2.2 菌株的生长曲线

如图3所示，LB培养基中菌株DGB-1、DGB-3和DGB-8在0～4 h生长较慢，处于迟缓生长期；4 h后细菌繁殖速度明显加快，进入对数生长期；12 h时后3株菌株生长速率又再次减慢并在24 h后逐渐进入稳定生长期。此外，在细菌培养的30 h内，DGB-1和DGB-3的生长速率无显著性差异；4～12 h，DGB-8的生长速率显著低于DGB-1和DGB-3，14 h后3株菌株的生长速率无显著性差异（图3）。基于3株菌株的生长特点，选择接种14 h菌龄的细菌开展后续PAE降解试验。

2.3 菌株的共代谢降解

如图4所示，不加糖的情况下，处理3 d后，加菌处理组MSM培养液中的PAE含量仅比对照下降0.89%～10.40%，仅DGB-1菌株对DBP和BBP的降解率与CK有显著差异。这说明不加糖情况下DGB-1、DGB-3和DGB-8对6种PAE的降解能力均较差。添加D-纤维二糖后，菌株DGB-1对DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP的降解率分别为47.8%、89.5%、100.0%、100.0%、56.4%和79.4%；菌株DGB-3对DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP的降解率分别为50.7%、90.9%、100.0%、100.0%、53.2%和74.9%；菌株DGB-8对DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP的降解率分别为11.1%、20.8%、30.5%、29.4%、10.1%和13.2%。以D-纤维二糖为共代谢基质，可显著提高3株菌株对6种PAE的降解能力。DGB-1与DGB-3对6种PAE均有较高的降解能力，两者之间无显著差异，而DGB-8对6种PAE的降解率均显著低于DGB-1和DGB-3。Feng等^[10]的研究结果也表明，添加醋酸钠作为外源碳源可显著促进巨大芽孢杆菌YJB3对PAE的共代谢降解^[23]。这可能是由于PAE、多环芳烃（PAH）等有机污染物很难直接作为碳源被微生物利用^[23]，而糖类、有机酸和氨基酸等化合物在为微生物提供营养的同时，也可为微生物生长代谢提供电子受体或供体，从而促进微生物对有机污染物的降解能力，该共代谢现象在高分子量、难降解的有机污染物中较为常见^[16，24]。

由于DGB-1具有较好的PAE降解能力，且对氨苄青霉素有较高的抗性，所以选择DGB-1开展共代谢降解条件优化试验。

2.4 菌株DGB-1的共代谢降解条件优化

2.4.1 PAE生物降解的影响因素 吐温80常作为增溶剂促进介质中PAE溶解^[20]。不同初始吐温80添加量对6种PAE降解率的影响如图5A所示。 吐温80添加量在0.006%～0.100%，DBP和BBP的降解率均接近100%；而DMP、DEP、DEHP和DnOP的降解率随着吐温80添加量增加呈先增加后下降的趋势。当吐温80添加量为0.025%时，6种PAE的降解率均达最大值（图5A），因此最佳吐温80添加量为0.025%。

在吐温80添加量为0.025%条件下， 不同共代谢基质（碳源种类）对6种PAE降解率的变化如图5B所示。与不加碳源的CK比，所有碳源处理组6种PAE的降解率显著增加，说明5种碳源均可促进DGB-1对6种PAE的降解。这可能与添加碳源显著促进了细菌生长有关。通过酶标仪检测菌液的OD₆₀₀，发现添加碳源处理组OD₆₀₀（0.535～0.690）显著高于CK（0.107），即添加碳源，DGB-1的生物量得到显著提升。从碳源类型看，二糖（麦芽糖、蔗糖和D-纤维二糖）对DBP、BBP、DEHP和DnOP的促降解效果显著优于单糖（葡萄糖和果糖）。然而，二糖处理组菌液OD₆₀₀（0.535～0.568）均低于单糖处理组（0.639～0.690），说明细菌生物量增加不是促进PAE降解的唯一原因，可能参与二糖水解的部分酶类对PAE的降解有促进作用^[25-26]。此外，添加D-纖维二糖后，DGB-1对DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP的降解率分别达34.6%、65.9%、100.0%、100.0%、50.5%和44.4%，对部分PAE降解率显著优于麦芽糖和蔗糖。因此，最佳碳源种类为D-纤维二糖。

在最优吐温80添加量的条件下，不同D-纤维二糖浓度对6种PAE降解率的影响如图5C所示。随着D-纤维二糖浓度的增加，DEHP和DnOP的降解率不断增加，而DMP、DEP、DBP和BBP的降解率呈先增加后降低的趋势。检测DGB-1菌液的OD₆₀₀，发现D-纤维二糖浓度为1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和50 mmol/L时菌液OD₆₀₀值分别为0.207、0.464、0.585、1.373和1.423，说明随着碳源浓度增加DGB-1的生物量显著增加。当D-纤维二糖初始浓度为10 mmol/L时，除DEHP和DnOP外的4种PAE降解率均达到最大值，因此最优碳源浓度为10 mmol/L。

不同接菌量对菌株DGB-1降解PAE的影响如图5D所示。随着初始接菌量增加，6种PAE的降解率均呈增加趋势，证明细菌生物量增加可促进PAE降解。此外，菌株DGB-1菌液的OD₆₀₀由0.05增加至0.50，6种PAE的降解率仅增加1.25%～21.0%，说明细菌生物量增加不是影响6种PAE降解的主要因素。当初始接菌量OD₆₀₀≥0.2时，菌株DGB-1对DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP 5种PAE的降解率增加不显著，因此菌株DGB-1菌液的OD₆₀₀等于0.2为最优初始接种量。

以上单因素试验结果表明，菌株DGB-1的共代谢优化条件是吐温80添加量0.025%、10mmol/L的D-纤维二糖为共代谢基质、适宜接菌量是菌液的OD₆₀₀为0.20。此外，菌株DGB-1生物量的增加与PAE的降解率上升并不成比例，说明菌液生物量增加并不是提高PAE降解率的主要原因，添加碳源作为共代谢底物，菌株DGB-1细胞中催化PAE降解的酶活性增强可能是PAE加速降解的重要原因之一。

2.4.2 最优条件下菌株DGB-1对6种PAE的降解特性 基于最优降解条件，菌株DGB-1对不同初始质量浓度PAE处理3 d后的降解特性如图6所示。当PAE初始质量浓度≤20 mg/L，DGB-1可完全降解DBP、BBP和DEHP；DMP、DEP和DnOP的降解率最高可达48.6%、92.8%和100.0%，说明菌株DGB-1对6种PAE均具有良好的降解效果，且具备同时降解6种PAE的潜力。此外，6种PAE在MSM培养基中的降解动态均符合一级动力学方程（表1）。当PAE质量浓度为5 mg/L，DBP和BBP的t₁/2值分别为0.66 d和0.91 d，说明菌株DGB-1对短链PAE（碳链长度＜7）的降解速度较快。此外，菌株DGB-1对高相对分子质量、难降解的长链PAE如DEHP和DnOP的降解速度也很快（t₁/2值分别为1.08 d和0.67 d）。当PAE质量浓度增加至50 mg/L，DGB-1对PAE的降解半衰期均明显延长（DEP除外），其中DBP、BBP和DMP的半衰期延长1～2 d，而DEHP和DnOP的降解半衰期延长了6 d以上（表1）。这可能是由于高浓度PAE胁迫导致菌株DGB-1细胞生长速率的变化所致^[27-28]。

2.5 菌株DGB-1的PAE降解途径

微生物对PAE、PAH等有机污染物的降解主要依赖其降解酶^[10，29]，而酶的编码基因可能位于其基因组或质粒上^[30-31]，细菌对PAE的降解也可能是质粒和染色体上基因共同作用的结果。然而，菌株DGB-1是否携带质粒、质粒基因组中是否含有PAE降解基因尚不清楚。

2.5.1 菌株质粒DNA提取 以含质粒的枯草芽孢杆菌W34为对照，提取了菌株DGB-1的质粒DNA。如图7所示，菌株W34存在质粒，基因片段大小约2 kb，说明质粒提取方法适用于革兰氏阳性菌。然而，添加菌株DGB-1质粒DNA的泳道无条带，说明菌株DGB-1不携带可降解PAE基因的质粒。研究结果表明，菌株DGB-1的PAE降解基因位于该菌的染色体上。

2.5.2 粗酶液对PAE的降解作用 与细菌对其他有机污染物降解类似，细菌对PAE的降解主要依赖其酶的催化作用^[27，32]。不同培养基培养3 d后，菌株DGB-1的粗酶液对6种PAE的降解作用如图8所示。PAE胁迫条件下，与不加糖的CK比，加糖处理组DBP含量（图8A和8B）、DnOP含量（图8A）和DEHP含量（图8B）显著下降，说明PAE胁迫下加糖可激活DBP、DEHP和DnOP降解酶的活性。本研究发现加糖可以显著促进菌株DGB-1对DBP的降解（图4A），并且菌株DGB-1的粗酶液也具有一定的DBP降解能力，但粗酶液对DBP的降解率仅8.1%～12.8%（图8A和8B），说明菌株DGB-1对DBP的水解作用较弱。此外，加糖处理组MSM培养基培养细菌制备的粗酶液不具备DEHP催化活性（图8A），而寡营养培养基R2A培养细菌制备的粗酶液具有DEHP催化活性（图8B），说明菌株DGB-1降解酶基因的启动子可能为诱导型。然而，在PAE和D-纤维二糖的共同诱导下，虽然菌株DGB-1的粗酶液对DEHP和DnOP有一定的降解能力，但DEHP和DnOP的降解率仅为8.58%和7.78%，说明菌株DGB-1对DEHP和DnOP的水解作用也较弱。

2.5.3 细菌呼吸链系统对菌株DGB-1降解6种PAE的影响 上述分析表明，加糖条件下菌株DGB-1對DBP的降解率可达100%（图4A），但菌株DGB-1的胞内酶粗提液对DBP的水解作用较弱（图8），推测菌株DGB-1还存在其他的DBP降解代谢途径。因此，进一步研究了呼吸链系统（氧化还原酶系）对菌株DGB-1降解PAE的影响。

DNP作为解耦联剂可以抑制细菌细胞膜上的氧化磷酸化过程，从而抑制细菌的呼吸作用^[33]。如图9A所示，与CK相比，加糖不加DNP处理下，DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP的降解率分别为41.10%、81.26%、100.00%、97.67%、41.25%和79.41%，加糖加DNP处理组6种PAE的降解率分别为24.81%、51.20%、60.00%、48.80%、30.37%、61.47%，比加糖不加DNP处理均显著下降，说明DNP抑制了6种PAE的降解。同样不加糖时，加DNP处理的降解率亦低于不加DNP处理。此外，加糖不加DNP处理组与加糖加DNP处理組菌液OD₆₀₀分别为0.766和0.761，表明DNP对菌株DGB-1生长的影响不显著。说明菌株DGB-1细胞膜上的呼吸链系统参与了6种PAE的降解代谢。

Mn²⁺和Ni²⁺属于过渡金属离子，具有可变的氧化数，可与底物（PAE）发生电子交换作用，从而促进底物的氧化还原过程^[34-35]。如图9B和9C所示，添加Mn²⁺和Ni²⁺显著促进了菌株DGB-1对6种PAE的降解，且随着Mn²⁺和Ni²⁺浓度增加PAE降解率均呈增加趋势。这说明细胞膜氧化还原反应的增强可促进PAE降解。

3 结论

从大蒜中筛选获得3株PAE降解菌DGB-1、DGB-3和DGB-8，鉴定分析均为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。虽然3株菌能以6种PAE为碳源生长，但对6种PAE的降解能力均较弱。糖类可显著促进3株细菌对PAE的共代谢降解。添加糖类作为生长基质，菌株DGB-1和DGB-3对DBP和BBP的降解率可达100%。吐温80添加量、碳源种类、碳源浓度和细菌接种量对菌株DGB-1生长及PAE降解均有显著影响。最佳降解条件是吐温80添加量0.025%，10 mmol/L的D-纤维二糖为共代谢基质，菌株DGB-1接种量OD₆₀₀为0.2。研究还发现菌株DGB-1不携带质粒，说明该菌的PAE降解基因位于其染色体上。菌株DGB-1可同时通过水解和氧化还原2种途径降解PAE。其中，在PAE和D-纤维二糖的共同诱导下，菌株DGB-1可通过水解途径完成对DBP、DEHP和DnOP的第一步降解，但对这3种PAE的水解作用较弱；菌株DGB-1可通过氧化还原途径降解DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DnOP，添加Mn²⁺和Ni²⁺显著提高了菌株DGB-1对这6种PAE的降解速率。

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（責任编辑：石春林）