环形泰勒虫TA13815 蛋白的原核表达及反应原性分析

戚姣姣， 蒋 晨， 赵洪喜

（宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021）

环形泰勒虫（Theileria annulata）是一种专性寄生于细胞内的血液性原虫[1—2]，主要感染黄牛和水牛等反刍动物，给全球养牛业造成了重大的经济损失，除了其引起的直接和间接损失外，杀螨剂、抗蜱虫的费用也相当高。患病动物主要的临床症状表现为发热、乏力、体表淋巴结肿大、贫血、消瘦等[3—4]。环形泰勒虫病是典型的虫媒传染病，在我国主要通过小亚璃眼蜱、残缘璃眼蜱等硬蜱传播[5]。受传播媒介活动季节的影响，该病有很强的季节性和流行性，我国每年的5—9 月是此病的暴发季节，9 月以后逐渐消失[6]。环形泰勒虫病在全球分布很广，从北非和南欧延伸到中东欧和亚洲，在我国长江以北13 个省（区、市）都有此病的报道[7]，其中在新疆、宁夏、甘肃此病的感染率较高[8]。据调查，全球有2.5 亿头牛受到此病威胁，每年因此损失大约8 亿美元[9]。环形泰勒虫病已成为阻碍农业经济发展的重要疾病之一[10]，世界动物卫生组织将其列入了最新公布的动物疫病名单[11]，在我国将其列为二类疫病。

目前，国内对环形泰勒虫的检测方法主要有常规PCR 法、LAMP 法、多重PCR、实时荧光定量PCR等，这几种检测方法各有优缺点，但尚缺少理想的血清学诊断方法[12]。本研究通过在线软件分析序列可知，环形泰勒虫TA13815 蛋白是一个典型的跨膜蛋白，将其与亲缘关系较近的东方泰勒虫核苷酸序列进行同源比对，核苷酸同源性为53%，蛋白同源性为68%，表明该蛋白可作为候选靶标抗原诊断热带泰勒虫病。本试验以环形泰勒虫TA13815 为研究对象，进行基因克隆和原核表达，并对其进行反应原性分析，旨在为利用此蛋白建立一种牛环形泰勒虫病诊断方法提供技术支持[13—14]。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体及试剂

1.2 环形泰勒虫转化细胞和血清

分别从牛的血液和蜱的唾液腺中获取梨形虫体期和子孢子期的环形泰勒虫，从环形泰勒虫感染的细胞系中获取裂殖体。环形泰勒虫转化细胞和血清由中国农业科学院兰州兽医研究所外媒寄生虫与虫媒疫病团队提供。

1.3 TA13815 基因的生物信息学分析

通过NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）获取TA13815 基因核苷酸序列(XM_947071.1)，用DNAMAN 软件和在线软件分析TA13815 基因序列，网站信息见表1。

表1 各生物信息分析软件网址

1.4 环形泰勒虫gDNA 的提取

按照说明书进行gDNA 提取，用于后续目的基因的扩增。

1.5 引物的设计与合成

根据GenBank 公布的环形泰勒虫TA13815 核苷酸序列（XM_947071.1）可知，该基因全长642 bp。用Premier 5.0 设计1 对扩增去除跨膜区的TA13815 基因截短片段（49 bp—582 bp）引物，片段大小为534 bp，送到生工生物工程（上海）有限公司（以下简称上海生工）进行合成。引物序列为TA13815-F：5’-gctgatatcggatccgaattc TAT －TACGTTTCTGTGGATATAGACTGGC-3’（酶切位点为EcoR I），TA13815-F：5’-ctcgagtgcggccgcaagcttGGACTTAAAATCCGATTTTTTCCC-3’（酶切位点为Hind III）。

1.6 目的基因的扩增、原核表达及表达产物的纯化

TA13815 基 因 的 扩 增 体 系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，r Taq DNA 聚合酶0.3 μL，TA13815 上下游引物（20 μM）各1.0 μL，环形泰勒虫阳性基因组1 μL，RNase Free H2O 补足至25 μL。PCR 产物经验证正确后胶回收处理纯化并连接到pGEM-T Easy 载体中，然后转入到DH5α 感受态细胞，送到上海生工进行测序。测序正确的阳性菌所对应的胶回收产物与双酶切后的pET-30a 表达载体用同源重组酶连接，并转入至Rosetta（DE3）感受态细胞中，经扩大培养后，通过菌落PCR 和双酶切验证后送到上海生工进行测序。

1.7 蛋白的诱导表达和可溶性分析

将含有pET30a-TA13815 重组质粒和空载体pET-30a 的阳性克隆按1∶100 接种到含100 mg/L 卡那霉素的新鲜LB 液体培养基中，37 ℃，220 r/min培养至菌液OD600为0.6~0.8 h，进行诱导时间和IPTG 浓度的条件优化。加入IPTG 诱导表达后，6 000 r/min 离心10 min 收集菌液沉淀，加入PBS洗涤，用超声细胞破碎仪冰上破碎25 min，12 000 r/min离心15 min 后，取超声后的沉淀和上清液进行SDS-PAGE 电泳，分析重组蛋白可溶性。

1.8 表达产物的纯化

用10 mL pH 为7.8 的c（尿素）=8 mol/L 溶解诱导表达后的菌液沉淀，超声以破碎菌体，在4 ℃条件下12 000 r/min 离心10 min，取上清与镍亲和柱4 ℃过夜结合后，收集其流穿液分析重组蛋白结合情况，之后分别向镍亲和柱加入pH 为6.0 的5 mL洗涤液1 和pH 为5.3 的洗涤液2，将镍亲和柱冲洗3 次。最后向镍亲和柱中加入10 mL pH 为4.0 的洗脱液进行洗脱，用1.5 mL EP 管分别收集所有流出液。

1.9 Western-blot 分析

将纯化的TA13815 重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。将PVDF 膜用甲醇活化，使用半干转方法，将重组蛋白用电转仪25 V、25 min 转印到PVDF膜上，之后用0.05 g/mL 脱脂乳（例如：2 g 脱脂乳用40 mL1×TBST 溶解）封闭剂4 ℃孵育过夜，分别用0.05 g/mL 脱脂乳按照1∶50 比例稀释加入抗His标签蛋白的单克隆抗体、环形泰勒虫阳性血清、健康牛血清，室温孵育1 h。用1×TBST 洗4 次，每次间隔15 min。最后按照1∶10 000 比例稀释加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体进行第2 次孵育1 h，然后用1×TBST 洗涤4 次，每次间隔15 min，使用ECL显色剂，观察结果，分析该重组蛋白与抗His 标签蛋白的单克隆抗体、环形泰勒虫阳性血清和健康牛血清的反应原性。

1.10 环形泰勒虫RNA 提取及反转录反应

按照TRIzol Reagent 说明书进行总RNA 提取。提取后的总RNA 进行凝胶电泳验证后，立即按照Vazyme 反转录试剂盒说明书进行反转录。获得的cDNA 在-20 ℃保存备用。

1.11 TA13815 蛋白在环形泰勒虫不同发育阶段的丰度检测

根据NCBI 环形泰勒虫TA13815 基因的核苷酸序列（XM_947071.1），用Premier 5.0 设计1 对引物，引 物 序 列 为TA13815-2F：5’-GAGCGGAAAATGGAAGGAAG-3’，TA13815-2R：5’-GTAAGACCAGAAAGCCCAAAG-3’，作为实时荧光定量PCR 引物；Ta-β-actin-F：5’-GAGACCACCTACAACAGCATCATG-3’，Ta-β-actin-R：5’-CACCTTGATCTTCATGGTGCTGGG-3’，作为实时荧光定量PCR 内参引物。以环形泰勒虫子孢子cDNA、裂殖体cDNA 和梨形虫体cDNA 为模板，进行荧光定量PCR 扩增。根据结果计算相应的2_ΔΔCt。

2 结果与分析

2.1 TA13815 基因生物信息学分析

通过NCBI 发现，该基因全长642 bp，无内含子，编码213 个氨基酸。预测蛋白质分子质量为29.663 ku，pI 为4.41。信号肽预测结果显示，环形泰勒虫TA13815 蛋白有信号肽，位于1 aa—16 aa（图1A）。跨膜区结果显示，环形泰勒虫TA13815 蛋白有跨膜区，跨膜结构域的位置在4 aa—21 aa和195 aa—212 aa（图1B）。显示TA13815 蛋白是跨膜蛋白，适合用于环形泰勒虫检测试剂盒的检测。二级结构与结构域模式预测见图1C、图1D，IEDB在线软件预测B 细胞抗原表位见图1E。东方泰勒虫核苷酸同源性与蛋白同源性均小于68%（图1F）。

图1 生物信息学分析

2.2 TA13815 基因扩增及重组质粒构建

基因特异性扩增得到大小约为534 bp 的目的片段（图2A），并进行双酶切鉴定（图2B）。

图2 目的基因扩增（A）与双酶切鉴定结果（B）

2.3 重组蛋白的诱导表达和纯化

将测序正确的pET30a-TA13815 重组质粒及空载体pET30a 阳性单克隆加入IPTG 进行诱导表达，离心后用PBS 清洗，超声破碎结束后进行离心，通过SDS-PAGE 检测该蛋白主要以包涵体形式存在，将包涵体使用c（尿素）=8 mol/L 溶解，然后通过包涵体纯化方式纯化该蛋白（图3、图4）。

图3 重组蛋白诱导表达

图4 重组蛋白纯化

2.4 重组蛋白反应原性分析

对重组蛋白TA13815 进行Western-blot 分析，结果显示，重组蛋白TA13815 与健康牛血清不反应，与环形泰勒虫阳性血清和抗His 标签蛋白反应良好，结果见图5。

图5 TA13815 纯化蛋白的Western-blot 分析

2.5 丰度检测结果

将环形泰勒虫转运蛋白基因和内参基因βactin 分别在子孢子、裂殖体和梨形虫体3 个阶段Ct 值作差，再代入公式2_ΔΔCt中进行计算。裂殖体阶段的转录水平为1，子孢子阶段的转录水平为0.628 8，梨形虫阶段的转录水平为0.562 1，结果显示环形泰勒虫TA13815 基因在环形泰勒虫3 个阶段均有表达，且在红细胞阶段中表达量最高（图6）。

图6 TA13815 mRNA 在不同发育阶段的表达水平

3 讨论与结论

环形泰勒虫病，也被称为热带泰勒虫病，是由环形泰勒虫感染所引起的一种蜱传性疾病。牛环形泰勒虫寄生于宿主血细胞内，有很强的地方流行性，症状多呈急性型，发病率和死亡率均很高，常引起牛致死性白细胞增殖，一旦疾病暴发会造成很大损失[15]。本试验通过构建和表达环形泰勒虫TA13815 蛋白，分析该蛋白的反应原性，为建立一种牛环形泰勒虫病诊断方法提供技术支持[16—17]。

利用在线软件ExPASy org 分析TA13815 蛋白的理化性质，结果显示TA13815 蛋白原子总数为C1409H2164N380O431S1，理论上等电点为5.46。该蛋白19种氨基酸组成中，（Asp+Glu）占31 个带负电荷，（Arg + Lys）占27 个带正电荷；在蛋白两端有2 个跨膜区，信号肽位于1—16。故构建原核表达载体时，避开了跨膜区。对其蛋白进行二级结构预测，结果显示在组成的二级结构中，α-螺旋（h）占比18.77%，β-折叠（e）占比34.27%，无规则卷曲（c）占比46.95%。通过在线软件Sorce 预测蛋白的抗原表位，结果显示B 细胞抗原表位有6 个，表明该蛋白有很好的抗原性，可以成为刺激机体产生免疫应答的抗原分子。将环形泰勒虫TA13815 蛋白与亲缘关系较近的东方泰勒虫核苷酸序列进行同源比对，同源性为53%，蛋白同源性为68%，表明该蛋白可作为候选靶标抗原诊断热带泰勒虫病。通过SDSPAGE 和Western-blot 对诱导表达的蛋白进行可溶性和诱导条件分析，结果显示TA13815 蛋白主要在包涵体中。使用c（尿素）=8 mol/L 纯化后的蛋白大小高于诱导表达后的蛋白，原因可能是c（尿素）=8 mol/L 对纯化蛋白的大小产生了影响，使蛋白存在翻译后修饰。对表达纯化的蛋白进行Western-blot试验，结果显示，重组蛋白可以与感染环形泰勒虫的牛血清发生反应，与阴性牛血清无交叉反应，证明TA13815 蛋白具有很好的反应原性。通过丰度检测可知，环形泰勒虫TA13815 mRNA 在梨形虫各个阶段均有表达，可以实现在感染早期作出诊断。

环形泰勒虫TA13815 蛋白是一个典型的跨膜蛋白，本试验避开信号肽和跨膜区表达了TA13815蛋白。环形泰勒虫TA13815 蛋白具有较多的抗原表位，且可在虫体表面持续检测到该蛋白表达刺激机体持续产生相关抗体。这表明该蛋白具有很好的抗原性，可以作为刺激机体产生免疫应答的抗原分子。本试验成功构建了pET30a-TA13815 重组质粒，表达了TA13815 蛋白，可以为建立一种良好的血清学检测方法提供技术支持。