发酵纤维素阴离子衍生物的转化与抗菌应用评价

2023-06-07崔艳丽李顺尧张天宇张敏燕鲍祥祥毛旸易

浙江大学学报（理学版） 2023年3期

崔艳丽，李顺尧，张天宇，张敏燕，鲍祥祥，毛旸易

（1.浙江大学化学系，浙江杭州 310058；2.郑州财经学院，河南郑州 450044；3.武汉大学，湖北武汉 430072）

碳达峰碳中和是一个多维、立体、完整的系统工程。21 世纪已从“石油精炼”依赖向“生物精炼”时代开启。纤维素是地球上最丰富的天然有机物，占植物界碳量的50%以上。纤维素由于具有可持续性、可降解性、生态协调性及多羟基衍生化能力强等特点广受青睐，特别是对功能性纤维素衍生物的研究与开发。提取油脂后的米糠中大约含有50%纤维、20%蛋白质以及10%植酸钙等。常见的纤维素结构修饰有物理修饰、化学修饰（硫酸化、磷酸化、乙酰化等）和生物工程修饰。经生物改造后纤维素分子量和单糖的分布发生变化［1-2］。本文通过对发酵后的米糠纤维素进行化学改造，制备带阴离子的纤维素衍生物，在文物保护、农产品保存、日常防护等中用于抗真菌。全世界有500 多万种真菌，侵袭性霉菌问题日益严重，如文物保存中易受霉菌侵害，农作物在运输、保存中由于受霉菌侵害被大量丢弃等，人类面临变异微生物的劫难。以往用抗真菌剂进行接触性消杀，对人体具有一定的毒性，且会引起微生物变异产生耐药性。PERFECT［3］在抑制真菌途径、靶点和作用机制的基础研究中，对第1～第3 代抗真菌剂进行了总结，指出多糖衍生物是未来的抗菌剂前沿，其具有成膜性，能作为物理屏障阻碍病菌侵入，克服了现有技术的弱点，且对保护对象生态友好，易被接受；带电荷的纤维素可通过其携带的电荷与微生物表面直接作用，由于其独特的抗微生物途径，不惧怕微生物的变异及不同的微生物品种来源，从而具有抑制微生物感染或直接杀伤微生物使其失去感染的能力［3-5］。

现有大多纤维素的衍生物反应条件有待提升，如利用离子液体、不易处理的DMSO 等有机溶剂、无机盐混合物等，成本高、后处理麻烦、转化率低等［6-10］。本文首次将经微生物改造的纤维素作为原料，在水相条件下采用阴离子醚化剂（3-氯-2-羟基丙磺酸钠，CHPASA）通过一锅法进行阴离子化，反应中使用的氢氧化钠溶液既作为反应物，又作为溶剂，还具有催化剂作用；反应条件温和，取代度适中，转化率较高。采用元素分析、核磁共振、傅里叶红外光谱（FTIR）等方法表征纤维素衍生物的组成和结构，并进行了抑真菌生物评估。纤维素阴离子衍生物具有可降解、生态环保、易接受等优点，可用于文保材料如皮革、纸张、石材等的抗菌保护；同时因其具有亲和、低价等特点，可用于农产品的保存；在大范围的防疫抗菌助剂等应用中亦具有潜力。

1 实验

1.1 主要仪器与试剂

集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S，上海），冷冻干燥器（FE-1A-50，上海），元素分析仪（vario MICRO cube，德国），红外光谱仪（Nicolet iS 10，美国），核磁共振仪（Bruker Avance Ⅲ 500 MHz，德国）。发酵米糠（酵母发酵7 d，自制），3-氯-2-羟基-三甲基磺酸钠（上海，分析纯），氢氧化钠（上海，分析纯），盐酸（上海，分析纯），去离子水。

1.2 纤维素阴离子衍生物的制备

称取干燥的发酵米糠1 g，置于烧瓶中，加入l4% NaOH 溶液18 mL，搅拌，随后加入3-氯-2-羟基丙磺酸钠。在一定温度（室温，50 ℃，70 ℃，90 ℃）下反应12 h，冷却后用稀盐酸溶液中和，用8 000 Da分子质量的透析袋透析48 h，冷冻干燥，称重，放入干燥器备用。

1.3 元素分析与取代度

采用元素分析仪测试阴离子纤维素衍生物样品中的含硫量（S%），推算阴离子基团取代度（DS）。DS 为纤维素大分子每个失水葡萄糖单元上被取代基团的平均羟基数。S%与DS 的关系为

1.4 红外光谱与取代基团

干燥样品在研钵中与KBr 混合研磨，压片后在400～4 000 cm-1范围进行FTIR 表征分析。

1.5 体外抑真菌活性评价

调整好菌悬液（选用黑曲霉、出芽短梗霉和嗜松青霉）的密度，并均匀涂布于凝结的平板培养基。先对标准滤纸（直径6 mm）灭菌，分别蘸取一定浓度发酵纤维素阴离子衍生物Y1 的水溶液，风干后贴于平板表面，其中1 片为灭菌后的滤纸，用于空白对照，3 片为处理后的滤纸，在平板培养基上25 ℃下培养48 h，测定抑菌圈大小。

2 结果与讨论

2.1 纤维素与CHPASA 反应

纤维素是由D-吡喃葡萄糖单元以β-1，4 苷键脱水而成的均多糖，具有复杂的四级结构。每个葡萄糖残基上有3 个羟基，其中6 位上的属于伯羟基，2，3位上的属于仲羟基。一般情况下伯羟基的反应能力比仲羟基强，且具有空间位阻小的优势；在氢氧化钠作用下，阴离子醚化剂自身发生反应，即3-氯-2-羟基丙磺酸钠的氯与邻位的羟基形成环氧化合物，环氧化合物活性高，在碱性条件下迅速与纤维素发生亲核取代反应，将阴离子基团引至纤维素羟基的氧原子上，获得阴离子纤维素衍生物，具有绿色环保的特点，不需要有机溶剂，与醚化剂共同作用，便可打开纤维素的氢键网络。同时发酵的纤维素，也会破坏一定的分子高级结构，去掉部分基团，从而使纤维素大分子羟基更易反应。

2.2 反应体系的选择

纤维素大分子内部及分子之间存在氢键，难以在常规的溶液或熔融状态下发生反应，因而其应用大受限制。已有报道认为，所有的有机溶剂、无机混合溶剂和离子液体等都是为了破坏其高级结构。进攻纤维素羟基的反应，首要的是破坏其氢键网络。本文采用经酵母发酵7 d 的米糠纤维素，通过脱油、脱水获得易参与反应的粗纤维；为方便后处理且降低成本，将一定浓度NaOH 溶液作为反应体系，在此体系中，NaOH 不仅可以作为溶剂，破坏纤维素的高级结构，而且可作为反应试剂，进攻CHPASA 的氯原子，同时可作为催化剂，去掉纤维素羟基中的氢，改变其环氧结构，使亲核反应更易进行。实验初期，体系为棕色分散液，随着反应的进行，纤维素网络被打开，得到半透明浑浊液，说明纤维素分子已遭其他分子攻击，二级结构被破坏，得到新的纤维素衍生物分子，其形态亦由不透明的棕色固体原料变为浅黄色固体产物。阴离子醚化剂先生成反应活性强的环氧化合物，其实质就是用碱催化烷氧基进攻羟基形成醚。

图1 纤维素结构与氢键分布［12］Fig.1 Cellulose structure and its hydrogen bond distribution

图2 阴离子醚化剂与纤维素的反应Fig.2 Etherification of fermented cellulose with CHPASA

2.3 反应条件对取代度的影响

前期的探索实验表明，反应温度、反应体系的NaOH/CHPASA 物质的量之比、CHPASA/纤维素物质的量之比均可影响产物的反应取代度。反应时间取12 h。

温度对纤维素衍生物取代度的影响结果见表1。由表1 可知，适当升高温度，可加快分子的运动，有利于促进亲核反应，提高取代度，但是温度过高，醚化剂会产生副反应，不利于主反应的发生。

表1 温度对阴离子纤维素取代度的影响Table 1 Effect of temperature on degree of substitution of anionic cellulose

一般情况下醚化剂的投料更多，因为1 个葡萄糖残基有3 个未反应的羟基，CHPASA/纤维素物质的量之比为9，说明针对一个单糖残基的1 个羟基有3 个醚化剂参与进攻反应；由表2 可知，一味增加CHPASA/纤维素物质的量之比，虽能提高取代度，但提高有限甚至有所减小，综合考虑环保与成本，取CHPASA/纤维素物质的量之比为7。

表2 CHPASA/纤维素物质的量之比对阴离子纤维素取代度的影响Table 2 Effect of CHPASA/cellulose molar ratio on degree of substitution of anion cellulose

体系的酸碱度对反应影响很大，当碱性偏强时，醚化剂产生很多副产物，影响主反应。但需保持适当的碱性，以保证环氧的形成和羟基的去质子化。由表3 可知，当NaOH/CHPASA 物质的量之比为1时，取代度最高。

表4 纤维素阴离子衍生物Y1 的抑菌效果Table 4 Antifungal effect of cellulose derivative Y1

综上，优化反应条件为反应温度65 ℃，NaOH/CHPASA 物质的量之比1、CHPASA/纤维素物质的量之比7。

2.4 核磁共振图

图3 为纤维素阴离子衍生物Y1 的1H-13C NMR谱图（溶剂：D2O，温度：25 ℃），横坐标为1H 化学位移，纵坐标为13C 化学位移。

图3 发酵纤维素阴离子衍生物Y1 的二维NMR 谱图Fig.3 2D 1H-13C NMR spectrum of cellulose derivative Y1

从图3 中可看到，Y1 中有9 种碳，与氢谱的化学位移大小对应，并且是单取代；（5.31×10-6，99.33×10-6）处为葡萄糖单体异头碳的化学位移［11］；相关点并不杂乱，貌似单糖产物的图谱，说明经过发酵后纤维素更易反应，并且其大分子已展开，无其他基团存在；化学位移（3.10×10-6，53.73×10-6）处为与磺酸基连接的亚基，这充分说明已成功引入了阴离子醚化剂基团；其他7 个点的氢谱化学位移从3.49×10-6至4.20×10-6不等，碳谱化学位移从60.09×10-6至76.13×10-6分别为葡萄糖单元5 个碳与醚基上另外2 个碳的归属。

2.5 傅里叶红外光谱图

图4 为400～4 000 cm-1的发酵纤维素与发酵纤维素阴离子衍生物的FTIR 谱。产物与原料比较，呈现了一些特异吸收峰。由图4 可知，3 415.96 cm-1附近出现的较强吸收峰是由分子O—H 伸缩振动引起的；2 926.81 cm-1处出现的吸收峰由亚甲基伸缩振动引起；1 639.97 cm-1附近的峰为羟基与自由水形成的氢键吸收峰；这3 个吸收峰构成了多糖的特征吸收峰。在1 043.33 cm-1处，由C—O 伸缩振动产生；在615.94 cm-1附近有1 个S—O 特征吸收峰。核磁共振谱图亦证明，纤维素与阴离子醚化剂反应后，带阴离子的基团被成功引入大分子中。

图4 发酵米糠纤维素阴离子衍生物Y1 与发酵米糠纤维素FTIR 谱图Fig.4 Comparison of infrared spectra between cellulose derivative Y1 and fermented cellulose

3 抑制真菌实验

抑制真菌实验选定的含菌量约为1×107～2×107CFU·mL-1，纤维素阴离子衍生物Y1 的浓度为40 mg·mL-1。纤维素阴离子衍生物Y1 对3 种真菌的抑菌效果均表现为中敏，对黑曲霉的抑菌效果相对较强。考虑纤维素阴离子衍生物Y1 具有生态、可降解等优势，在文物保护、农产品储存及长期抗疫防护等方面具有应用潜力。