梅毒螺旋体比较基因组学研究进展

赵思思,赵飞骏

南华大学衡阳医学院病原生物学研究所,湖南衡阳 421001

梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)是苍白密螺旋体属中的苍白亚种,其引起的梅毒是一种严重危害人类健康的性传染性疾病。梅毒发病率不断升高,中国每年报告的梅毒诊断数呈逐年递增趋势[1-2]。随着基因测序技术日趋完善,基因组学得到了巨大的发展。比较基因组学通过比较分析Tp与其他致病性螺旋体的基因组数据,揭示Tp与其他致病性螺旋体的相似性与差异性,以帮助了解Tp的生物特性和致病机制等。因此,本文综述Tp基因组、Tp和其他致病性螺旋体基因组比较,以探讨Tp的致病机制。

1 Tp基因组

Tp基因组为环状染色体,有最小的螺旋体基因组,大小约为1.14 Mb,G+C的平均含量为52.8%[3]。预测Tp蛋白质分子量为3 235～72 869 Da,等电点为3.9～12.3[3]。Nichols株是第一个完成全基因组测序的Tp菌株,目前已相继完成了标准株SS14株、Chicago株、DAL-1株、Mexico A株、Sea81-4株的全基因组测序[3-8]。Tp菌株间基因序列相似性水平>99.8%[9]。

1.1 Nichols株

1912年,Nichols株从华盛顿特区的一名神经梅毒患者的脑脊液中被分离出来,并于1998年3月完成了首次测序工作[3]。2012年,科学家使用新的测序方法对Nichols株进行了第二次测序[4]。两种测序方法得到的数据有些微差异[4]。NCBI最新数据显示Nichols株基因组大小为1 138 011 bp,有1 010个蛋白质编码区(coding sequence,CDS)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_000919.1)。根据Riley的分类方案,Nichols株中有577个承担预测生物学功能的开放阅读框(open reading frame,ORF),177个可与其他物种假定蛋白质相匹配的ORF,还有287个没有数据库匹配的ORF[3]。Nichols株中可以发生tprK变异,但其变异速度较低[10]。

1.2 SS14株

SS14株从亚特兰大的一名二期梅毒患者身上被分离出来,该患者对青霉素过敏且对红霉素治疗无效[4]。SS14株对红霉素表现出高水平耐药性,这是人们第一次在致病性密螺旋体中发现与临床相关的抗生素耐药性[11]。2007年8月,SS14株进行了首次全基因组测序工作,2012年12月,研究者使用新的测序技术更新了基因组测序结果。NCBI最新数据显示SS14株基因组大小为1 139 457 bp,有1 014个CDS(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_021508.1)。SS14株的基因组测序结果首次揭示了Tp的全基因组变异性[12]。

Matejkova等[12]发现,SS14株与Nichols株相比有327个单核苷酸变化、14个缺失和18个插入,这其中不包括高度可变的tprK基因变化[12]。使用新的测序方法校正Nichols株和SS14株的全基因组数据后,这两种菌株的蛋白质组发生了显著变化,提示Nichols株和SS14株代表了不同的Tp菌株亚群[4]。SS14株和Nichols株基因组之间的重要差异主要存在于23S rRNA、tp0326、tp0868和tp0127基因中[5]。在SS14株的23S rRNA基因中的A2058G点突变,是SS14株对大环内酯类药物耐药的原因[11]。体外测试表明,SS14株对各种抗生素的敏感性均低于Nichols株[4]。此外,SS14株基因组中的tprK基因变异性比Nichols株基因组中的tprK变异性高得多,SS14株基因组鉴定的菌株内异质性也显著高于Nichols株[4]。SS14株和Nichols株之间的多样性比SS14株和Mexico A株基因组之间的多样性大很多[4]。

1.3 Chicago株

1951年,Chicago株从梅毒患者的原发性硬下疳中被分离出来,其可以在兔睾丸内生长良好[6]。2009年9月,研究者成功完成了对Chicago株基因组的测序。NCBI最新数据显示Chicago株基因组大小为1 139 281 bp,编码989个CDS(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_017268.1)。与Nichols株基因组相比,Chicago株有44个核苷酸替换、21个缺失和75个插入[6]。Chicago株tprK序列具有高度多样性,而Nichols株的tprK基因变异较慢[10]。

1.4 DAL-1株

1991年,DAL-1株从达拉斯的一名二期梅毒孕妇的羊水中被分离出来;2011年11月,美国研究者组合使用454测序、Solexa测序和Sanger测序确定完整DAL-1基因组序列[5]。NCBI数据表明其基因组大小为1 139 971 bp,包含986个CDS(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_016844.1)。

1.5 Mexico A株

1953年,Mexico A株从居住在墨西哥的一名患有原发性梅毒的18岁男性患者体内被分离出来[7]。NCBI最新数据显示,Mexico A株基因组大小为1 140 038 bp,编码986个CDS(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_018722.1)。与Nichols株相比,体外培养的Mexico A株生长速率和运动性降低[13]。Mexico A株在目前研究的所有Tp菌株中拥有最大的基因组,其基因组有1 140 038个碱基。Mexico A株的两个基因tp0326和tp0488结合了Tp和苍白密螺旋体极细亚种的特异性核苷酸序列,这可能是因为单个宿主同时感染两种菌株时菌株间进行了基因重组,这证明密螺旋体亚种之间可以进行水平基因转移[7]。对Mexico A株的G+C含量、密码子和氨基酸使用以及基因位置进行分析,预测其有77个基因能水平转移[7]。Mexico A株基因组与SS14株基因组亲缘关系最近。Mexico A基因组与SS14基因组相比只有175个替换、85个插入和28个缺失;与Chicago株基因组相比有419个替换、18个插入和20个缺失,而与Nichols基因组相比有438个替换、94个插入和38个缺失[7]。

1.6 Sea81-4株

Sea81-4株于1980年从西雅图的一名患者的原发性硬下疳中被分离出来,在2012年完成了测序[8]。NCBI最新数据显示,Sea81-4株基因组大小为1 139 203 bp,有1 000个CDS(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP003679.1)。与其他5种Tp分离株不同,Sea81-4株静脉接种感染兔模型后会导致中枢神经系统持续感染[8,14]。

编码假定毒力因子的基因、参与细胞结构和过程的基因和编码DNA复制、修复和重组的基因,是Tp不同菌株间基因差异的主要发生位点。相比之下,编码一般代谢、转录、翻译、基因调控和转运成分的Tp基因是保守的[7]。Tp菌株之间的遗传差异首先在tprD基因和tp0126～tp0127基因间的区域中被发现[5]。tprK基因在Tp各菌株之间具有高度变异,这种变异使得Tp可以逃脱免疫清除,导致宿主的慢性感染[15]。来自不同实验室的Nichols株的tprK基因在经过几十年的独立传代后仍只有很小的序列多样性[10]。但除Nichols株外,其他菌株均已鉴定出基因序列多样性高的tprK基因[10]。tprK序列的多样性位于7个可变区域(V1～V7)和保守区域的两侧[16]。在Tp感染期间,T细胞免疫反应针对tprK的保守区,而抗体反应针对V区[17]。tprK的多样性随着Tp在兔睾丸中的连续传代而积累,其中V6是V区中变化最大的[16]。

2 Tp和其他螺旋体基因组比较

2.1 Tp和其他苍白密螺旋体基因组比较

近年来全基因组测序结果表明,密螺旋体是高度克隆的生物,其基因组的细微差异可导致疾病的临床表现和宿主范围的深层次差异[5]。对人致病的密螺旋体有苍白密螺旋体和品他密螺旋体。苍白密螺旋体又分为3个亚种,分别为苍白亚种、极细亚种和地方亚种。除此之外,还有一种未分类的类人猿密螺旋体分离株(Fribourg-Blanc)。梅毒螺旋体、雅司螺旋体和Fribourg-Blanc螺旋体关系密切,这三者无法通过形态学、蛋白质电泳、细菌生理学或宿主免疫反应来区分[18]。

2.1.1 Tp和雅司螺旋体基因组比较 雅司螺旋体是雅司病的病原体。雅司病是一种热带病,主要以皮肤、关节、软组织和骨骼影响为特征。一般来说,雅司螺旋体的毒性比Tp小[9]。尽管Tp和雅司螺旋体会引起完全不同的疾病,但这两个亚种的基因组总差异仅为0.36%～0.37%;提示Tp和雅司螺旋体之间存在极大的序列相似性[5,18]。使用下一代测序技术确定了3种雅司螺旋体菌株的完整基因组序列,其基因组长度为1 139 330～1 139 744 bp[9]。

Tp和雅司螺旋体之间的大部分遗传差异主要累积在6个基因组区域中,包括第122位的tp0138(tpF1)、16S rRNA、tpp15(tp0171)的5′侧翼区域和3′侧翼区域、第579位的gpd(Tp0257)、tp0326(Tp92)以及tprI和tprC,这些基因位点的差异可能导致了Tp和雅司螺旋体之间致病性的差异[9]。在tpp15的5′侧翼区域和3′侧翼区域中发现的序列变化可以将Tp与其他密螺旋体区分开来,包括雅司螺旋体、地方密螺旋体和Fribourg-Blanc密螺旋体[18]。

2.1.2 Tp和Fribourg-Blanc株基因组比较 Fribourg-Blanc株是1962年从非洲几内亚的一只狒狒中分离出来,能够感染仓鼠及人类[18]。Fribourg-Blanc株在所有不可培养的密螺旋体中有最大的基因组(1 140.4 kb)[9]。Fribourg-Blanc分离株在tp0696～tp0697之间的基因间区域中鉴定出了DNA重复,因此Fribourg-Blanc分离株不太可能包含Tp菌株中缺失的任何独特DNA区域[9]。在tprK供体位点所在的基因组区域中,苍白密螺旋体和Fribourg-Blanc分离株之间存在高程度的相似性和序列保守性(99.57%),其进化关系非常密切[9]。此外,Fribourg-Blanc分离株与雅司螺旋体的关系比与Tp的关系更密切[9,19]。

2.2 Tp和其他致病性螺旋体基因组比较

通过比较Tp与其他不同属的致病性螺旋体间的基因差异(表1),可以进一步揭示Tp的生物学特性。

表1 螺旋体基因组的特征

2.2.1 Tp与问号钩端螺旋体基因组比较 问号钩端螺旋体的基因组由两条环状染色体组成,其基因组大小远大于Tp和Bb[22]。问号钩端螺旋体共有4 727个CDS,4 360个位于CⅠ上,367个位于CⅡ上,所有rRNA和tRNA基因都位于CⅠ上。问号钩端螺旋体、Tp和Bb有315个同源基因[22]。与Tp不同的是,问号钩端螺旋体缺乏编码己糖激酶的基因,但其有Tp中不存在的编码完整长链脂肪酸利用系统、三羧酸循环(TCA)和呼吸电子传递链的基因[22]。因此,Tp的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)产生方式与问号钩端螺旋体不同,Tp通过糖酵解途径生成ATP,而问号钩端螺旋体通过氧化磷酸化产生ATP[22]。除此之外,问号钩端螺旋体通过编码完整的氨基酸和核苷酸生物合成代谢系统来获得营养[23],而Tp编码广泛的转运体从宿主获取营养[24]。与Tp一样的是,问号钩端螺旋体使用FlaA鞘蛋白和FlaB核心蛋白作为其内鞭毛细丝的基本成分[22]。

2.2.2 Tp与伯氏疏螺旋体基因组比较 Bb最显著的特征之一是有一个不寻常的基因组,其中包含一个线性染色体和许多线性/环状质粒[25]。Bb的线性染色体包含了853个基因,编码一组用于DNA复制、转录、翻译、物质转运和能量代谢的基本蛋白质[20]。同时,Bb的11个质粒上的30个基因中,大多数没有已知的生物学功能[20]。

Tp和Bb之间差异有显著性,两个病原体基因组的整体直系同源系数值约为0.43[26]。参与核心生物学功能的基因同源性很高,而参与特定过程的基因存在显著的变异性[26]。Tp和Bb有476个ORF同源,其中有76%具有预测的生物学功能,24%编码功能未知蛋白质[3]。编码功能未知蛋白的ORF中有近50%是螺旋体独有的,这组螺旋体属独有的蛋白质可能决定了螺旋体结构和生理的特殊性,可能与Tp和Bb感染人类并引起慢性传播性疾病的能力有关。此外,Tp中有90个功能未知的ORF与Bb染色体上的编码基因相匹配,没有ORF与Bb质粒上的编码基因匹配,表明质粒是Bb所特有的[3,20]。Tp的第三密码子位置有G或C偏向,Bb在该位置有A或T偏向,这使得Tp基因组中的G+C含量几乎是Bb基因组中的两倍[3]。Tp与Bb基因组之间不同的G+C含量会造成总体密码子使用的偏差,是预测编码序列中的氨基酸组成不同[20]。

2.2.3 Tp和齿垢密螺旋体基因组比较 齿垢密螺旋体是一种与牙周病相关的口腔螺旋体。齿垢密螺旋体的基因组构象与Tp一致,但其基因组大小比Tp大得多[21]。齿垢密螺旋体预计编码2 786个CDS,其中734个CDS是独特的[21]。尽管Tp和齿垢密螺旋体基因组大小显著不同,但这两种病原体间存在的稳定RNA的数量几乎相同[21]。有观点认为,1.14 Mb的Tp基因组是由齿垢螺旋体缺失和(或)分化而来[27]。Tp基因组与齿垢密螺旋体基因组可以共享有限的核苷酸相似性,大约25%的齿垢密螺旋体基因与Tp基因组中68%的CDS最匹配[27]。除了编码核糖体和鞭毛蛋白的高度保守操纵子外,Tp基因组与齿垢密螺旋体基因组之间基本上不存在同线性[27]。与齿垢密螺旋体相比,Tp没有公认的限制修饰系统、插入序列元件或噬菌体[21]。Tp基因组编码一个有12个成员家族(TprA-L)的假定膜蛋白,这个家族蛋白具有免疫保护性和调理活性,编码这些蛋白的基因家族在不同亚种和菌株之间表现出异质性[28]。齿垢密螺旋体中也拥有一个与该基因家族相关的成员,即TDE0405,其编码齿垢密螺旋体的主要外鞘蛋白[28]。同时,Tp和齿垢密螺旋体都具有磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)的HPr、酶Ⅰ和酶ⅡA,但没有PTS转运蛋白复合物,表明这些蛋白质在Tp和齿垢密螺旋体体内只起着调节作用[21]。齿垢密螺旋体中存在糖酵解和TCA循环,表明其产生ATP的方式与Tp相似都是由糖发酵产生。但与Tp不同的是,齿垢密螺旋体可以从头合成脂肪酸、辅因子和核苷酸[21]。

3 展 望

比较基因组学应用于Tp,使Tp的生物特性、进化方向以及致病机制等方面更进一步得到了解。目前已经有许多Tp标准株和临床株的全基因组测序工作已经完成。通过Tp菌株间的比较,Tp的主要突变区域和保守区域被明确,这为梅毒疫苗的开发奠定了坚实的基础。比较Tp基因组与其他致病性螺旋体基因组的差异为研究Tp的致病机制提供了新的方向。