饲料及饲料原料中沙门氏菌污染状况研究

孙玉林，谢 灿，赵雄艳，王 宇*

（1.昆明市技术合同认定登记站，云南 昆明 650021；2.官渡区水生动物监督管理站，云南 昆明 650206；3.官渡区动物疫病预防控制中心，云南 昆明 650206）

动物饲料是“从农场到餐桌”食品安全链的第一个环节，饲料被病原菌污染可导致人类食源性疾病。病原菌污染饲料的方式途径不一，饲料中的沙门氏菌主要有二个来源[1]：一是原料本身携带有沙门氏菌，二是外源性的。既可能来自于植物性原料如大豆和谷类作物的污染、动物源性饲料如鱼粉、骨粉、羽毛粉等污染、微生态制剂及酶制剂中病原菌污染及加工环境造成的交叉污染等，这些被病原菌污染的饲料进入生物体内后可通过其产品转移、传播，危害人类健康。沙门氏菌是一种严重威胁人类及动物生命健康的病原菌，被沙门氏菌污染的饲料往往是人和动物被感染的源头。从饲料生产、经营和使用环节抽取饲料及饲料原料进行沙门氏菌检测，以期摸清饲料中沙门氏菌的污染情况，为进一步加强和完善饲料微生物安全监测工作提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源及种类

饲料生产、经营和使用环节抽取配合饲料80批、动物性饲料原料35批包括鱼粉、肉骨粉、羽毛粉和血粉，植物性饲料原料56批、微生态制剂10批、酶制剂12批、饲料生产企业加工车间粉尘5批、微生态制剂生产原料9批，样品共计207批。

1.1.2 培养基和试剂

BPW缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿肉汤、XLT4琼脂、沙门氏菌显色培养基；细菌基因组DNA快速提取试剂盒、Taq PCR Master Mix；EB、琼脂糖、DNA Marker DL2000。

1.1.3 仪器

恒温摇床（Thermo）、恒温培养箱（德国Memmer）、台式高速冷冻离心机（Sigmas）、梯度PCR仪（SENSO）、电泳仪（GE）、凝胶电泳成像分析系统（Gei Doc XR）、微生物鉴定系统（美国Sensititre）。

1.1.4 引物

以沙门氏菌invA基因为基础，选择特异性引物，序列为F：5＇-GTGAAATTATCGCC ACGTTCGGGCA A-3＇，R：5＇-ATCGCACCGTCAA AGGAAXX-3＇。

1.2 试验方法

1.2.1 增菌培养

无菌称取样品25 g，于225 mL已灭菌的BPW肉汤中，37 ℃培养16～18 h，再取1 mL BPW增菌液于9 mL已灭菌的氯化镁孔雀绿肉汤中进行选择性增菌16～18 h。

1.2.2 模板DNA提取

样品增菌液DNA的提取采用试剂盒提取，具体步骤为：

①加入150μL Buffer CS，用1 mL Tips吹打或者Vortex震荡充分悬浮细胞沉淀→②加入5μL Proteinase K和300 μL Buffer CL，Vortex 10 s或者剧烈摇晃20次混合均匀，置于70 ℃水浴10 min。样品为革兰氏阳性菌和真菌可选步骤12，000×g离心2 min，将离心上清倒入或者用移液器转入另一个干净的1.5 mL离心管→③加入230μL无水乙醇或者95%乙醇（此时可能会出现絮状凝集物，不影响实验效果），温和翻转离心管10次混合均匀，避免产生大量泡沫，简短离心（离心速度达到 3，000×g后立即停止）去除离心管盖上的液体→④将步骤A4中的溶液和絮状物一起倒入或者用移液器转入DNA吸附柱-C30（置于收集管中）中，室温放置1～2 min或者更长时间→⑤12，000×g离心1 min，弃收集管，将DNA吸附柱-C30放入另外一个干净的收集管中→⑥在DNA吸附柱-C30中加入500 μL Buffer WAG，室温放置1～2 min或者更长时间，12，000×g离心1 min，弃收集管，将DNA吸附柱-C30放入另外一个干净的收集管中→⑦在DNA吸附柱-C30中加入500 μL Buffer WB1，12，000×g离心1 min，弃废液，将DNA 吸附柱-C30放回收集管中→⑧重复步骤A8→⑨12，000×g 离心2 min→⑩将 DNA 吸附柱-B转入试剂盒携带的1.5 mL 离心管中，向硅胶膜的中央加40～200 μL TE或者去离子水（pH≥7），将1.5 mL离心管的盖子扣在DNA吸附柱上，做好标记，去除DNA吸附柱的盖子。室温放置1～2 min 或更长时间，12，000×g 离心1 min。

1.2.3 PCR检测方法

PCR反应采用50 μL体系，组成如下为Taq PCR Master Mix 25 μL，dd H2O 18 μL，P1、P2各1 μL，模板5 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；95℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃保温5 min；4 ℃保存。每个试样重复2次，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。

1.2.4 PCR产物的电泳检测

配制1.5%的琼脂糖溶液，每100 mL琼脂糖溶液中加入5μL溴化乙锭溶液，混匀融化，稍适冷却后制胶、电泳，电泳结束于凝胶成像系统成像。

1.2.5 细菌鉴定

将PCR检测为阳性的样品增菌液划线接种于XLT4平板，挑取典型菌落进行分离纯化，采用微生物鉴定系统进行鉴定。

1.2.6 检测结果判定

PCR检测结果为阳性，划线接种于XLT4琼脂获得典型沙门氏菌菌落，经微生物鉴定系统鉴定为沙门氏菌则判定为检出沙门氏菌。

2 结果与分析

2.1 样品检测结果电泳图（图1）

图1 饲料及饲料原料中沙门氏菌PCR检测电泳图

样品中沙门氏菌检测PCR产物电泳图，样品中在阳性对照对应位置扩增出的DNA条带，为疑似沙门氏菌阳性样品；未扩增出的DNA条带，为沙门氏菌阴性样品。可看到泳道14、15及20、21对应的样品均为疑似沙门氏菌阳性样品，其余为沙门氏菌阴性样品。

2.2 疑似阳性样品平板鉴定（表1、图2）

表1 饲料原料及产品中沙门氏菌检测结果表

图2 平板检测结果图

饲料中沙门氏菌的检出率为3.9%，其中检出率由高至低分别为动物性原料、微生态制剂生产原料、微生态制剂、酶制剂、浓缩配合饲料。

3 讨论与结论

3.1 讨 论

沙门氏菌病是公共卫生学上有重要意义的人畜共患病之一，由它引起的食物中毒在世界各国的细菌性食物中毒中常常位居前列，蛋、家畜和肉制品是主要的传播媒介。因沙门氏菌污染饿饲料而导致畜禽大量死亡，给养殖业造成了巨大的经济损失[2-3]。传统的沙门氏菌检测方法需进行非选择性和选择性增菌、生化及血清学鉴定很费力、耗时，需4～7 d才能完成，其他如抗体检测法，虽然快速，但其高假阳性不适合于常规检测[4]。此外，低水平的病原菌污染，饲料加工后导致沙门氏菌的“致伤”及饲料中其他成分的干扰等因素，使得沙门氏菌的检测受到一些限制。因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。随着分子生物学技术的不断发展和进步，针对沙门氏菌开展的快速检测方法得到迅速发展，已经在沙门氏菌的准确、快速检测和鉴定中起到重要作用[5]。本研究以沙门氏菌特异的invA 基因为目的片段，invA基因是与沙门氏菌侵袭作用相关的高度保守的一段序列[6-7]，核苷酸序列在沙门氏菌属不同菌株具有较高的同源性，并且经BLAST检索未发现与其他物种有同源关系[8]，以此建立检测沙门氏菌的PCR法，对抽检的饲料样品，用PCR法和传统的细菌分离法进行了检测，提高了检验效率及灵敏度[9]。

3.2 结 论

本次监测结果显示，动物源性饲料、饲料成品以及微生态制剂、酶制剂等都存在沙门氏菌污染的情况。动物源性饲料是畜禽饲料中沙门氏菌的主要污染源，其中以骨粉、鱼粉、血粉等蛋白质饲料最易被沙门氏菌污染。饲料企业缺乏对原料和成品沙门氏菌的监测措施，对进厂的原料和出厂的产品未进行严格的控制，这是饲料污染沙门氏菌的重要因素之一。微生态制剂及酶制剂近年来在畜禽养殖业中得到了广泛应用，但对于其质量及安全性评价手段较为缺乏，本次监测不仅从市场上抽取了酶制剂及微生态制剂成品，而且抽取了生产环节的各原料及辅料进行了沙门氏菌的监控，均检出沙门氏菌。微生态制剂及酶制剂因其活性的问题不能经高温处理，或使用高温干燥器或挤压蒸煮器等加热设备杀灭细菌，经常直接用于饮水或拌料中供动物饲用，因此其安全性对于畜禽养殖业有至关重要的作用。

3.3 建 议

为了杜绝饲料被沙门菌等致病菌污染，饲料企业应加强对原料和成品的管理，不同原料和成品存放地和运输车辆应进行专门分配和划分，并定期消毒，对高风险的饲料原料如骨粉、血粉、羽毛粉等应提高甄别等级并与其他原料保持隔离；采取措施控制加工设备的粉尘，对粉碎和输送设备进行对应划分，在特定区域内发生污染时，可迅速对相关设备进行消毒等。

饲料安全是一个日益严重的问题，就全球而言，安全的饲料是畜牧业防止微生物污染的第一关也是最重要的一关，随着饲料行业的发展，关于饲料安全的法律法规也将更加严格和健全。饲料生产企业应加强致病菌的来源、危害和预防以及相关检验技术的培训，以提高企业对致病性微生物防控的能力。