不同群体日本沼虾的线粒体COI基因序列分析

黄 辉，刘 凯，王宇希，郭 炜，马恒甲，谢 楠

（杭州市农业科学研究院，杭州 310024）

日本沼虾（Macrobrachium nipponense）又名青虾，是中国主要淡水养殖虾类［1-3］，也是中国主要淡水名特优养殖品种之一［4］。中国的日本沼虾养殖起步于20 世纪60 年代中期［5］，70 年代后，日本沼虾养殖形成一定的生产规模，均以套养为主，直到80 年代末，日本沼虾养殖才步入发展的盛期，养殖规模迅速扩大，单产得到较大幅度的提高，养殖技术也在实践中逐步完善，经济效益显著提升［6］。目前，日本沼虾养殖过程中种质退化现象比较严重［7］，中国开展日本沼虾的良种选育，培育高品质品种，对于保障日本沼虾的种苗生产质量，促进中国淡水养虾业的健康可持续发展具有重要意义。本研究通过对5 个典型水域的日本沼虾进行线粒体COI基因序列比较研究，以此了解各群体间的遗传差异，从而为日本沼虾的良种选育及其养殖业的健康发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2021 年采集钱塘江（QT）、武义（WY）、高塘湖（GT），肇庆（ZQ）和南宁（NN）5 个不同群体的日本沼虾样本；样品取尾部肌肉，每个群体取样15 尾，保存于无水乙醇中，用于后续的群体遗传学分析。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 DNA 提取采用氯仿-异戊醇提取法［8］。DNA 经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，4 ℃保存备用。

1.2.2 序列PCR 扩增 上下游引物分别为VF1_t1 5′-TCTCAACCAACCACAAAGACATTGG-3′、VR1d_t1 5′-TAGACTTCTGGGTGGCCRAARAAYCA-3′（序列来源：https：//dnabarcoding101.org/lab/ bioinformatics.html）。PCR 扩增体系（50 μL）：10×Buffer 5 μL，Mg2+4 μL，dNTP 混合物4 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板50~100 ng，Taq酶2 U，灭菌ddH2O 补齐。PCR 反应程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环后72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR 产物送至上海派森诺生物科技股份有限公司，纯化后直接进行Sanger法测序。

1.2.3 序列分析 利用UGENE v41.0 软件［9］的MAFFT 模块对所测序列进行序列比对，trimAL 软件［10］进行对齐。对碱基差异大的序列，通过NCBI网站的在线BLAST 功能，去除非特异性扩增序列；然后利用Mega X 软件［11］，基于Kimura 2-parameter模型计算相对遗传距离；利用R 软件包poppr［12］得到NJ 系统发育树，自举次数为1 000，其中将罗氏沼虾序列（GenBank 号为MW602628）作为外类群（OUT），并利用R 软件包pvclust［13］进行层次聚类分析，距离指标设为abscor，聚类方法设为average，自举次数为1 000。利用DNAsp 软件［14］统计单倍型（h）、单倍型多样性（Hd）、核苷酸多样性（Pi）等遗传多样性参数。利用Arlequin 软件［15］基于Tajima’sD和Fu’sFs参数进行中性检验，并基于F统计量进行分子变异分析（Analysis of molecular variance，AMOVA）及计算各群体间的遗传分化系数。利用PopArt 软件［16］基于TCS network 网络构建单倍型网络图。

2 结果与分析

2.1 日本沼虾不同群体COI基因序列的碱基占比

将测序得到的75 个日本沼虾序列和1 个罗氏沼虾序列用UGENE v41.0 软件比对，并经trimAL 软件对齐及手工校正，得到669 bp 长度的碱基序列。每个序列均可翻译成相应的蛋白序列，共获得68 个样本序列，其中去除非特异性扩增序列8 个（ZQ 群体7 个，NN 群体1 个）。在67 个日本沼虾样本序列中，保守位点420 个、变异位点222 个、简约信息位点123 个、碱基缺失或插入位点27 个。利用SNP-site v2.5.1 软件将67 个日本沼虾样本序列转换为vcf 格式后，利用SnpSift v5.0e 软件计算平均转换与颠换的比值（TS/TV），为2.78。利用Mega X 软件计算各群体T、C、A、G 碱基的占比，由表1 可知，各群体的（A+T）占比均明显高于（G+C），表明本研究各群体COI基因序列的碱基组成具有明显的AT 偏倚性。此外，经SPSS v13.0 软件的ANOVA 分析发现，T、G 碱基组间存在显著差异（P＜0.05）。

表1 日本沼虾不同群体COI基因序列的碱基占比

2.2 日本沼虾不同群体COI 基因序列的遗传多样性参数

使用DNAsp 和Arlequin 软件计算日本沼虾的5个野生群体的遗传多样性参数，结果见表2。WY 群体的单倍型多样性最低（0. 895），QT、ZQ 群体的单倍型多样性最高（均为1.000），GT 群体的单倍型多样性较低（0.990）。ZQ 群体的核苷酸多样性最高（0.076 56），QT群体的核苷酸多样性最低（0.011 99）。

表2 日本沼虾不同群体COI基因序列的遗传多样性参数

中性检验结果显示，除GT 群体的Tajima’sD为正值外，其余群体均为负值；除ZQ 群体的Fu’sFs为正值外，其余群体均为负值。基于Tajima’sD参数，NN群体中性检验呈显著水平（P＜0.05）。基于Fu’sFs参数，GT、QT群体中性检验呈显著水平，P分别为0.001和0.000，远小于0.05。AMOVA 分析显示，99.56%的变异发生在群体内，仅0.44%的变异发生在群体间，群体间的遗传分化系数为0.004 42（P＜0.05）。

2.3 日本沼虾5 个野生群体的单倍型网络

日本沼虾5 个野生群体的单倍型网络（图1）显示，67 个日本沼虾样本定义了65 种单倍型，各单倍型具有一定的分化程度。来自NN 群体和QT 群体的单倍型形成了2 个主要分支。单倍型间节点较多，呈网状分布。NN 群体的单倍型呈线状分布；QT 群体则呈网状分布；GT 群体的单倍型相对较少，分布相对集中；WY 群体的单倍型分布跨度较大，与GT、QT 群体均有交集；ZQ 群体的单倍型分布较分散。

2.4 日本沼虾群体内及群体间的遗传距离

用Mega X 软件分析得出日本沼虾群体内及群体间的遗传距离，如表3 所示。5 个日本沼虾群体内遗传距离为0.008 6~0.086 1，群体间的遗传距离为0.016 4~0.072 5。其中ZQ 群体和NN 群体遗传距离要明显高于QT 群体和GT 群体遗传距离。

表3 日本沼虾不同群体内及群体间遗传距离

利用R 语言基于遗传距离分别用NJ 法和层次聚类法建立系统发育树（图2）和聚类树（图3）。QT群体和GT 群体遗传距离较近，与ZQ 群体和NN 群体相比遗传距离较远，WY 群体与QT 群体和GT 群体的遗传距离较小。

图2 NJ 法建立的系统发育树

图3 层次聚类法建立的聚类树

3 小结与讨论

不同地理群体日本沼虾的线粒体COI基因序列（A+T）含量均高于（G+C），呈现出明显的AT 偏好性，与红螯螯虾等其他无脊椎动物的COI基因序列研究结果一致［17］。所有日本沼虾样本序列中，保守位点420 个，变异位点222 个，简约信息位点123 个，碱基缺失或插入位点27 个，显著高于红螯螯虾［17］。但是，日本沼虾COI基因序列的平均转换与颠换比值为2.78，低于红螯螯虾［17］。在基因组中，转换与颠换的比值约为2。在蛋白质编码区，这个比值可以超过3［17］。可见，日本沼虾COI基因序列的平均转换与颠换比值在正常范围内。

物种的遗传变异是适应生境的必要条件［18］。Grant［19］认为，单倍型多样性大于0.5 且核苷酸多样性大于0. 005 时，遗传多样性较高。本研究中不同地理群体日本沼虾的单倍型多样性为0.895~1.000，核苷酸多样性为0.007 39~0.076 56，不同地理群体日本沼虾均表现出较高的多样性，其中，QT 群体和ZQ 群体表现出较高的单倍型多样性，ZQ 群体表现出较高的核苷酸多样性，与单倍型网络分析结果一致。这可能与ZQ 群体较少受到人类活动的干扰有关。在单倍型网络中，不同群体单倍型之间节点较多，ZQ 群体的单倍型分布较分散。依据Grant［19］提出的4 个群体扩张事件类型，本研究结果显示，不同群体日本沼虾的COI基因序列呈现高单倍型多样性和高核苷酸多态性的特点，总体来看符合具有长期进化历史的稳定群体特性。当Tajima’sD为负且达到显著水平，表明种群分化偏离中性选择，预示着在进化过程中受到了随机漂变、选择压力和瓶颈效应等影响，可能经历过群体扩张［20］。本研究中，NN 群体Tajima’sD为负且达到显著水平。Fu’sFs＞0，表明种群经历过遗传瓶颈事件，Fu’sFs＜0，表明种群趋于扩张或经历过选择扫荡［21］，本研究中，GT、QT群体的Fu’sFs为负且达到显著水平，表明这2 个群体经历过选择扫荡或瓶颈效应之后的群体扩张。

以罗氏沼虾为外类群，对不同地理群体日本沼虾COI基因进行测序，得到日本沼虾群体内及群体间遗传距离，基于遗传距离以及系统发育树和聚类树分析可知，QT 群体和GT 群体遗传距离较近，与ZQ 群体和NN 群体相比遗传距离较远。这有可能与QT 群体和GT 群体地理位置较近有关。WY 群体与QT、GT 群体的遗传距离较小，经Mega X 软件计算，分别为0.033 2 和0.030 3，甚至小于WY 群体内遗传距离（0.039 4）。对于WY 群体与QT、GT 群体，可以通过进一步的研究来明确它们之间的遗传关系。