工业发酵对雪茄茄芯中性香气成分的影响

潘 勇，李林林，方 欣，朱婷婷，周亚彬，胡 捷，王荣浩，刘 洋，谭再钰，杨 梅，黄友谊，施友志

（1.湖北中烟工业有限责任公司，武汉 430040；2.华中农业大学，a.园艺林学学院；b.生命科学技术学院，武汉 430070）

烟叶发酵是改善雪茄烟叶品质的重要工序，将在田间成熟及晾制完成的基础上进一步形成雪茄烟叶品质［1-3］。发酵处理使烟叶中的内含物质进一步分解和转化，并使得烟叶内各种化学成分更加协调；同时能够提高雪茄烟叶中性香气物质的含量，降低烟叶杂气和刺激性，获得更好的香气和吃味［4-8］。烟叶的工业发酵，又被称为深度发酵或二次发酵［9］，主要目的是弥补初次发酵的不足，或提升烟叶的风格特征，让烟叶成分更加协调，以提升烟叶的工业可用性［10，11］。目前在雪茄烟叶发酵方面的研究主要集中于初次发酵［8］，而对工业发酵方面的研究较少，尤其是工业发酵对雪茄香气的影响。本研究以工业发酵过程中不同阶段的雪茄茄芯为研究对象，分析发酵过程中茄芯中性香气成分的种类及含量的变化，筛选发酵前后的主要差异物质，分析工业发酵对茄芯中性香气成分的影响，为工业发酵提升茄芯烟叶品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料与试剂：试验烟叶为从洪都拉斯进口的雪茄烟品种HABANO 生产的茄芯烟叶（已调制和初次发酵）。二氯甲烷、正构烷烃（C8~C40）、乙酸苯乙酯等，均为色谱纯。

仪器与设备：同时蒸馏萃取装置，赛克斯玻璃仪器有限公司；RE-52AA 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；TRACE 1300+ISQ7000 气质联用仪，赛默飞世尔科技公司。

1.2 烟叶发酵及取样

雪茄茄芯的工业发酵按照湖北中烟三峡烟厂的生产技术标准要求进行操作，生产周期约4 个月（2019 年8 月23 日至12 月26 日）。在整个发酵过程中，由经验丰富的熟练加工人员根据堆垛发酵情况，对堆垛进行翻堆处理，并根据发酵时间和翻堆情况，在原料（8 月23 日）、前期（9 月24 日）、中期（10 月29日）、后期（11 月22 日）及出堆（12 月26 日）5 个阶段翻堆或出堆前按五点法取样，样品于-20 ℃保存。

1.3 中性香气成分的提取

使用水蒸气蒸馏-二氯甲烷溶剂萃取法（同时蒸馏萃取法）提取茄芯中性香气成分。在1 L 圆底烧瓶中加入5.0 g 烟样（过40 目筛）、0.5 g 柠檬酸、500 mL蒸馏水和50 μL 乙酸苯乙酯内标（2.226 μg/μL），使用恒温电热套进行加热；装置的另一端接盛有40 mL 二氯甲烷的250 mL 圆底烧瓶，该端烧瓶置于恒温水浴锅中加热，水浴温度为60 ℃，蒸馏萃取2.5 h。萃取完成后，加入过量无水硫酸钠干燥有机相，将有机相转移到茄形瓶，然后使用旋转蒸发仪浓缩至1 mL 左右，即得烟叶精油，用于GC-MS 分析。

1.4 GC-MS 分析条件

色谱柱：TG-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。载气：He，流速：1.0 mL/min。进样口温度为250 ℃，传输线温度为280 ℃。离子源温度为177 ℃。升温程序：初始温度60 ℃保留2 min，然后以2 ℃/min 的升温速度升至230 ℃，保留15 min。分流比10∶1，进样量为2 μL。电离能为70 eV，电离方式为EI。质量数范围为35~500 amu，溶剂延迟6 min。由GC-MS得出正构烷烃标样和发酵样品中各香气成分色谱峰的保留时间，计算物质的保留指数，经计算机通过NIST 谱库进行检索匹配，结合数据库中的匹配度和保留指数进行定性。假定校正因子为1，采用内标法进行半定量分析。

1.5 数据分析

数据整理及基本图表绘制使用软件EXCEL2006、SPSS23.0、Origin2019 和联川生物平台（www.omicstudio.cn）中云工具进行分析与绘制。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中茄芯中性香气成分的种类

为探究发酵对雪茄茄芯香气品质的影响，采用同时蒸馏萃取结合GC-MS 方法检测了雪茄茄芯不同发酵阶段中的中性香气成分，如表1 所示，从所有样品中共检测并鉴定出59 种中性香气成分。根据香气物质的结构，这些中性香气成分分为酮类、醇类、醛类、酯类、烃类、含氮化合物、芳香烃类和酚类8 类，其中酮类18 种（31%）、醇类14 种（24%）、醛类7种（12%）、烃类6 种（10%）、含氮化合物5 种（8%）、芳香烃类4 种（7%）、酯类3 种（5%）、酚类2 种（3%）（图1a），表明酮类、醇类是雪茄茄芯的主要中性香气成分。如图1b 所示，中性香气成分种类数量在雪茄茄芯发酵过程的变化较小，有40 种中性香气成分一直存在于发酵的所有阶段，表明工业发酵对雪茄烟叶中性香气成分的种类数量无明显影响。

图1 雪茄茄芯发酵过程中中性香气成分的种类占比（a）和种类韦恩图（b）

2.2 发酵过程中茄芯中性香气成分的动态变化

使用联川生物平台（www.omicstudio.cn）中二维PCA 云工具对发酵不同阶段的雪茄茄芯中性香气成分进行主成分分析，对数据进行z-score 归一化处理，以消除数值异常高的成分对后续分析的影响，减少数据间的“贫富差距”。如图2a 所示，茄芯的原料、出堆样品出现明显分化，而发酵前期、中期和后期聚在一起，表明发酵过程中茄芯中性香气成分的变化主要在原料和发酵前期之间，以及发酵后期和出堆之间，而发酵前期、中期和后期样品中中性香气成分的差异较小。发酵过程中雪茄茄芯中性香气成分总量及不同类型的含量如图2b 所示，中性香气成分总量呈先减后增的变化趋势，整体上发酵前后中性香气成分总量增加明显。不同种类中性香气成分的含量变化中，醛类、酯类的含量在发酵过程无显著性变化（P＞0.05），酚类、烃类的整体含量均呈显著增加（P＜0.05）；其余种类物质的含量在发酵过程中变化显著，但发酵前后的含量无显著差异（P＞0.05）。

2.3 发酵过程中茄芯中性香气成分的变化趋势

对雪茄茄芯深度发酵过程中中性香气成分进行STEM 变化趋势聚类分析，对数据进行预处理，以发酵原料为对照，计算所有样本相对原料的含量倍数（Fold change，FC），并对含量倍数取Log2FC，预先设计4 种变化趋势，变化跨度为2，将中性香气成分分配给每个趋势，结果如图3 所示。由图3 可知，发酵过程中茄芯中性香气成分只有1 种模式，即先减后增型的变化趋势显著（P＜0.05），该模式变化下共有10 种中性香气成分，包括茄酮、（2-trans，6-trans）-farnesal、新植二烯、植酮、8S，14-柏木二醇、法尼基丙酮、邻苯二甲酸二丁酯、15，16-二去甲-8（17），11-赖百当二烯-13-酮、香叶基芳樟醇、植物醇。其余3 种模式的变化趋势不显著（P＞0.05）。

图3 雪茄茄芯发酵过程中中性香气成分的STEM 变化趋势聚类（a）和显著性变化趋势聚类（b）

2.4 发酵过程中茄芯的主要差异中性香气成分

为了筛选出雪茄茄芯发酵过程中的主要差异中性香气成分，以原料样为对照，采用偏最小二乘法（PLS-DA）进行分析，结合独立样本T检验，以VIP＞1.0 和P＜0.05 为标准筛选发酵前后差异中性香气成分，结果如表2 所示。由表2 可知，从发酵过程中共筛选出14 种主要差异中性香气成分，包括酮类的茄酮、（+）-香柏酮、植酮、法尼基丙酮、15，16-二去甲-8（17），11-赖百当二烯-13-酮，醇类的8S，14-柏木二醇、柏木脑、香叶基芳樟醇、（1R，2E，4S，7E，11E）-4-异丙基-1，7，11-三甲基-2，7，11-环四烯-1-醇、植物醇；含氮化合物的3-乙酰基吡啶、2，3′-联吡啶，以及烃类的新植二烯、西松烯。

表2 雪茄茄芯烟叶发酵过程中的主要差异中性香气成分

3 讨论

发酵是调制的延续，也是改善雪茄烟叶品质的重要工序之一，香气是烟叶的重要评价指标［12，13］，烟叶中各类香气物质及其含量与其香型等品质特点密切相关［14］。本研究结果表明，一定程度的发酵整体上能够提高茄芯中性香气成分的含量，这与时向东等［15］的研究结果相符，但变化趋势有所不同；本研究中茄芯中性香气成分整体呈先减后增趋势，前、中期的香气总量减少，这可能是由于二次发酵前期温度上升较快，发酵温度较高，中性香气成分挥发速度过快，而香气前体物质等经过初次发酵含量有所下降，香气生成速度较慢所致。从工业发酵前后共筛选出14 种差异中性香气成分，这些成分是以质体色素降解产物为主，包括植酮、法尼基丙酮、新植二烯、香叶基芳樟醇、植物醇等；而质体色素降解产物是烟叶中主要香气成分之一，与烟叶感官品质关系密切［16］。此外，西柏烷类的茄酮，是烟草中含量最为丰富的中性香味成分之一，具有独特的香味；棕色化反应产物的3-乙酰基吡啶、2，3′-联吡啶等与烤香、烘焙香和坚果香等香味特征有关［17］，不同物质可能对感官质量的作用不同。工业发酵对雪茄茄芯原料具体感官品质的影响以及主要中性香气成分的代谢途径等还有待于进一步研究。

4 结论

在工业发酵过程中，雪茄茄芯中性香气成分的种类整体呈增加趋势，但变化较小；其中性香气成分的含量呈先减后增趋势，整体上含量明显增加；主成分分析表明中性香气成分在原料和发酵前期之间，以及发酵后期和出堆之间变化较大。共筛选出14种雪茄茄芯关键中性香气成分，包括茄酮、（+）-香柏酮、植酮、法尼基丙酮、15，16-二去甲-8（17），11-赖百当二烯-13-酮、8S，14-柏木二醇、柏木脑、香叶基芳樟醇、（1R，2E，4S，7E，11E）-4-异丙基-1，7，11-三甲基-2，7，11-环四烯-1-醇、植物醇、3-乙酰基吡啶、2，3′-联吡啶、新植二烯和西松烯。