黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌的体内保护作用

任明星，肖 涌，付书林，宗冰冰，2，3，邱银生

（1.武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，武汉 430023；2.农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，武汉430064；3.畜禽病原微生物学湖北省重点实验室，武汉 430064）

猪源肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal pathogenicEscherichia coli，ExPEC）是威胁养猪业的重要病原体之一，会导致较大的经济损失［1］。猪源ExPEC 可引起猪脑膜炎、关节炎、肺炎和败血症等致命性感染［2，3］。随着中国养猪业的快速发展，猪Ex-PEC 的分离率逐年提高。抗生素在临床上广泛应用于治疗ExPEC 引起的感染。研究表明，动物体内多抗生素大肠杆菌的分离率显著增加，95.2%的分离株对至少5 种抗生素具有耐药性，60.3%的分离株对10 种以上抗生素具有耐药性［4］。多重耐药大肠杆菌的出现，使预防和控制其临床感染变得更困难。然而，目前还没有能有效地预防和治疗猪ExPEC 菌株感染的措施。

Let U be the signal subspace matrix of covariance matrixSimilarly,there is a unique non-singularmatrix T,which satisfies

黄芩苷是一种从黄芩等药用植物中分离的黄酮类化合物［5］，具有抗菌、抗炎、抗微生物及抗氧化等药理作用［6］。研究表明，黄芩苷具有强大的生物活性，并具有重要的生物学功能，如对肺、子宫和其他器官具有抗炎、抗氧化和抗癌作用［7，8］，还能够降低副猪嗜血杆菌毒力，调控炎症信号通路，减弱炎症反应达到抗菌效果［9，10］。黄芩苷可减轻金黄色葡萄球菌引起的人肺泡上皮A549 细胞损伤，降低其对A549 细胞的黏附，并显著减弱小鼠巨噬细胞对金黄色葡萄球菌的炎症反应［11］。黄芩苷能显著降低鸡的死亡率和减轻肺组织病理改变，达到对禽致病性大肠杆菌（APEC）诱导鸡急性肺损伤的保护作用［12］。黄芩苷可通过干扰QS、生物膜的形成和毒力基因的表达来降低APEC 感染的鸡Ⅱ型肺细胞的细胞损伤［13］。黄芩苷可以抑制生物膜的形成，减弱群体感应控制的毒力，并增强小鼠模型中铜绿假单胞菌的清除［14］。猪源ExPEC 危害严重且无有效预防和治疗措施，已证明黄芩苷对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和APEC 等多种细菌的毒力表型具有抑制作用［13-15］。因此，推测黄芩苷在猪源ExPEC 致病过程中发挥的作用。

本研究选用黄芩苷作为治疗药物，探讨黄芩苷在猪源ExPEC 感染小鼠过程中发挥的作用，探究黄芩苷是否对猪源ExPEC 感染小鼠具有保护作用，以期为猪ExPEC 提供了一种新的潜在药物治疗方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药品 黄芩苷原料药92%（生产批号：C031B180101），购自四川协力制药股份有限公司。

菌株：试验用菌株PCN033，为血清型O11 的强毒株，由华中农业大学谭臣教授馈赠，武汉轻工大学动物科学与营养工程学院实验室保存。

1.1.2 试验动物与菌株 试验动物：五周龄昆明小鼠45 只，雌性，购自湖北省疾病预防控制中心，饲养3 d，期间按时更换垫料，保证充足的饲料和饮水。

存活率试验感染后，称量并记录感染后小鼠的体重变化。感染初期（0~24 h），各组小鼠的体重均急剧下降，而黄芩苷治疗组体重下降程度相对于感染组要缓慢；感染中期（24~36 h），各组小鼠的体重基本保持不变；感染中后期（36 h 后），各组小鼠的体重维稳，且有一定程度回升（图1）。黄芩苷在猪源肠外致病性大肠杆菌感染早期，可以减缓小鼠体重下降，但是后期感染组小鼠和治疗组小鼠的体重均开始回升。因此，体重变化仅能反映黄芩苷在感染初期对猪源肠外致病性大肠杆菌感染小鼠的体重下降程度有一定的减缓作用，但是否能达到最终的保护效果仍需进一步研究。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 存活率试验：随机将30 只小鼠分为3 组，每组10 只小鼠，分别为空白对照组、感染对照组和50 mg/kg 黄芩苷治疗组。组织载菌量试验：随机将15 只小鼠分为3 组，每组5 只小鼠，分别为空白对照组（不感染不给药）、感染模型组（感染后不给药）、药物治疗组（感染后给药）。

1.2.2 存活率试验 饲养3 d 观察无异常后，进行攻毒和药物处理。采用腹腔感染，细菌以106CFU 的剂量腹腔接种感染组和治疗组小鼠（治疗组皮下多点注射黄芩苷），接种同样剂量PBS 溶液的小鼠作为空白对照组。观察并记录感染后小鼠的临床表现、体重变化、采食量变化及存活情况等。

1.2.3 组织载菌量试验 组织载菌量试验（剖检病变观察、组织载菌量计数、病理切片），感染组和治疗组小鼠接种107CFU 的菌液（治疗组皮下多点注射黄芩苷），空白组小鼠注射等量PBS 溶液作为对照。感染6 h 后麻醉小鼠采血（EP 管中提前放入肝素钠防止凝血），打开其胸腔，进行心脏灌流后分离脏器（EP 管中放有1 mL PBS 溶液和灭菌钢珠），包括心脏、肝脏、脾脏、肾脏。观察组织解剖病变后，将取出的脏器部分用于组织载菌量计数。经称重、研磨后，取合适稀释度均匀涂布于LB 固体平板上计数，计算出各菌株在脏器中的含菌量（CFU/g）。

1.2.4 组织病理学观察 取灌流后各脏器的部分组织制备病理切片，将组织浸泡于4%多聚甲醛固定，切片、包埋、染色，最后在光学显微镜下观察各组织病变。

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黄芩苷治疗组小鼠的心脏、肝脏、脾脏和肾脏中的细菌计数与感染PCN033 的小鼠相比降低。黄芩苷治疗后，菌体在小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏中的定殖能力极显著下降（P＜0.01）（图3）。组织载菌量试验结果表明，黄芩苷抑制了猪源肠外致病性大肠杆菌在小鼠组织中的定殖。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重变化

1.1.3 仪器 全自动样品快速研磨仪购自上海净信实业发展有限公司；LDZX-75L 型立式高压蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂；ZHWY-103B 型迷你型多振幅轨道摇床购自上海智城分析仪器制造有限公司；PX224ZH 型电子天平购自奥豪斯仪器（上海）有限公司；ZRQSVP500 型Millipore-Q 超纯水机购自美国默克有限公司。

2.2 小鼠临床症状及存活率

组织载菌量剖检时发现感染PCN033 的小鼠组织器官有不同程度的病变，且黄芩苷治疗后有一定程度好转。感染PCN033 后，心肌纤维溶解甚至消失，炎性细胞渗出；肝细胞肿大变形；脾脏炎性细胞浸润增多；肾间质炎症细胞浸润；与感染PCN033 的小鼠相比，黄芩苷治疗组小鼠的心脏、肝脏、脾脏和肾脏中的病理变化均明显减少。黄芩苷治疗后，小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏的病理变化均明显减弱，表明黄芩苷治疗后，PCN033 感染小鼠后各组织器官产生的病变明显减弱（图4）。

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图2 感染组与治疗组小鼠存活率

2.3 组织载菌量试验结果

深度学习的本质是构建一种具有多种隐藏层的机器学习模型，通过进行海量的数据训练，获取具有价值的特征，最终实现正确的分类或准确的预测[12]。深度学习[13]正是通过应用基于卷积神经网络[14]的学习机器设备，以日臻智能化的教学辅助手段，帮助学习者在掌握一定认知规律的基础上进行高效度的知识强化训练，使学习者的认知能力与学习成效得到更为有效的提升。

2.4 组织病理切片试验结果

感染组和治疗组小鼠相对于对照组均表现出一定程度的症状，如精神萎靡、蜷缩无力、食欲不振等，而治疗组小鼠在感染初期与感染组症状程度相当，24 h 后治疗组小鼠相对于感染组小鼠症状有一定程度好转，与体重变化结果基本一致。感染组小鼠在24 h 出现死亡病例，而黄芩苷治疗组小鼠全部存活。黄芩苷治疗组小鼠存活率相对于感染组高10 个百分点（图2）。虽然黄芩苷对猪源肠外致病性大肠杆菌感染的小鼠具有一定的保护作用，但是单独使用黄芩苷治疗猪源肠外致病性大肠杆菌并不能达到很好的治疗效果。

其次，这部小说的结构也具有一定的象征意义。福斯特在写作这部小说时，将隐喻和转喻两种修辞手法糅合于整部小说的结构中，因此，《印度之行》这部小说就具有了双重结构。《印度之行》这部小说结构包括表层结构和深层结构，小说的表层结构是直线型的，这种结构形式能够促使小说情节按照时间顺序发展；小说的深层结构是循环型的，这种结构形式能够深化小说的主题，揭示其主题思想。

3 小结与讨论

ExPEC 由于其特殊的毒力因子而区别于肠内致病性大肠杆菌，在肠道定殖却不致病，而是能够引起肠外多种组织器官病变［1］。猪源ExPEC 在养猪业造成了重大的经济损失［1，2］。中国养殖场中猪源Ex-PEC 的分离率逐渐提高，且大多分离株为多重耐药菌株［4］。因此，迫切需要找寻新的治疗方法来解决该问题。

黄芩苷是提取自中药黄芩的一类黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性。研究表明，黄芩苷在抗炎、抗氧化、抗癌等过程中发挥重要的作用［7，8］，影响多种细菌的致病性［16，17］。黄芩苷通过抑制大肠杆菌1 型鞭毛系统相关基因的表达，降低黏附能力与迁移能力，抑制生物被膜的形成，使大肠杆菌侵袭能力下降［16］。黄芩苷能够抑制副猪嗜血杆菌多种毒力基因的表达，降低其致病性［17］。目前，黄芩苷对动物源ExPEC 致病性的作用研究多集中在APEC，猪源ExPEC 的研究少有报道。因此，选用黄芩苷为研究对象，探究黄芩苷对猪源ExPEC感染小鼠是否具有保护作用。

猪源ExPEC PCN033 已在猪和小鼠中成功建立感染模型［2，18，19］。小鼠存活率试验结果表明，在猪源ExPEC 感染小鼠后，可引起明显的病变。黄芩苷治疗后减弱小鼠的临床病变，减缓小鼠的体重下降趋势，减弱组织病理损伤，并一定程度上提高了小鼠的存活率，与黄芩苷在APEC 中的研究结果趋势一致［12，13］。猪源ExPEC PCN033 已被报道在感染猪和小鼠后会引起多组织器官的炎症病变［2，18，19］。研究表明，黄芩苷能抑制LPS 诱导上皮细胞炎性因子的表达来降低炎症反应［20，21］。黄芩苷能够调控炎性信号通路的表达来控制脑缺血再灌注引起的神经细胞损伤、抑制LPS 诱导的小鼠空肠炎症损伤及人单核细胞炎症反应［21-24］。为进一步探究黄芩苷减弱猪源ExPEC 致病性的机制，比较黄芩苷治疗组和感染组的组织载菌量试验以及组织病理切片。组织载菌量试验结果显示黄芩苷治疗后，猪源ExPEC 在小鼠各组织中的定殖能力显著减弱，病理切片结果显示黄芩苷治疗后，猪源ExPEC 在小鼠不同器官组织中产生的病理损伤显著减弱，炎性病变显著减弱，与之前的研究结果基本一致［12，21，22］。因此，黄芩苷对组织损伤的保护以及最终对小鼠的保护作用可能是黄芩苷影响了菌体在组织细胞中定殖能力，减弱了细菌的侵袭力。考虑到黄芩苷可通过抑制毒力基因的表达，减弱大肠杆菌的侵袭力［16］，推测黄芩苷可能通过抑制猪源的毒力因子从而减弱其致病性。结合黄芩苷在多种细菌中的抗炎作用［7，8，16］，推测黄芩苷可能是通过抑制相关炎性信号通路来降低猪源ExPEC感染后的炎症反应，减轻组织细胞的损伤，从而达到对组织器官的保护作用，降低小鼠死亡率。

本研究初步证实黄芩苷对猪源ExPEC 的体内感染具有保护作用，黄芩苷抑制猪源ExPEC 致病性的具体机制还有待进一步研究。