连云港市海岸潮间带沉积物细菌多样性及群落组成

姚 金，刘奕苇，张继鸾，李嘉乐，吴大力，王洪斌

（江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏连云港 222005）

细菌作为海洋生态环境中生物群落的重要组成部分，在物质循环中发挥重要作用，特别是在有机物污染的生物修复中起关键作用［1］。很多学者进行了特定自然生态系统细菌生物多样性的研究［2-5］。随着分子生物学技术的发展，16S rRNA 测序技术广泛应用于细菌生物多样性研究［6，7］。对海洋沉积物样品采用不同的DNA 提取方法及高通量测序技术，能获取更多的细菌群落信息，且能反映特定环境的细菌多样性状况［8］。

沉积物中细菌群落通过交互代谢活动来影响N、P 等营养元素的物质循环，代谢物通过自身或其他途径传递到水体，从而影响水体的营养状况；同时，水体中的化学物质通过自然沉降等途径进入沉积物，为细菌提供营养，影响沉积物中细菌的群落结构及种群数量；潮间带由于受人类活动的干预，生态条件往往不一样，导致细菌多样性及群落结构的差异。潮间带沉积物细菌群落结构及组成多样性的研究可以反映水体的污染状况，同时也是细菌分子生态学研究的一个重要方面［9，10］。

连云港市位于江苏省北部，随着社会经济的快速发展，大量陆生有机污染物排入近海海域，有机污染问题非常严重，海湾生态系统受到不同程度的污染［5］，而这种破坏性污染直接或间接地引起细菌多样性及群落结构的改变。对江苏省连云港市海岸潮间带沉积物细菌多样性的研究罕见报道，本研究以连云港市3 个典型海岸潮间带的泥沙沉积物为研究对象，应用IIIumina Miseq 测序并分析测序结果，得出沉积物细菌生物多样性及群落结构，探讨环境与细菌的演替规律，为细菌资源开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 采样点的设置及沉积物样品采集

2017 年5 月，在连云港市海岸3 个潮间带（墟沟、东西连岛、西墅）分别随机设置3 个采样点：墟沟（SXG1、SXG2、SXG3）、东西连岛（SLD1、SLD2、SLD3）及西墅（SXS1、SXS2、SXS3），采样点经纬度见表1。

表1 采样点的经纬度

根据潮汐规律在最低潮时采样，潮间带分为高、中、低3 个潮区，分别设置采样点，将采样管（内径4.8 cm 的不锈钢管，长30 cm）打入表层，管内沙子样品高度达10 cm 时塞上橡胶塞，取出采样管，将泥沙样品装入1 000 mL 采样瓶（无菌处理），采样瓶装入带冰的密封箱，4 ℃冰箱保存，待用。

1.2 沉积物理化因子检测

总碳（TOC）的测定：重铬酸钾-浓硫酸容量法；总氮（TN）的测定：锌-镉还原法；电导率的测定：PHS-3C型酸度计；pH的测定：DDB-303A电导率仪。

1.3 细菌富集、总DNA 提取

将5 g 沉积物样品接种至2216E 液体培养基，振荡培养（28 ℃、48 h）。新鲜菌液装入1.5 mL 离心管，12 000 r/min、5 min 离心后弃上清液，收集菌体，试剂盒（Bacterial Genomic DNA Extraction Kit，购自TaKa-Ra）抽提细菌总DNA，琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.4 16S rRNA 扩增及测序

将细菌基因组DNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海派森诺生物科技股份有限公司，对细菌16S rRNA 的V4 区进行PCR 扩增，以扩增产物为模板进行Illumina MiSeq 测序文库的制备并分析测序结果。

引物序列：520F（5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′）；802R（5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′）

2 结果与分析

2.1 沉积物理化因子特征

由表2 可知，3 个采样点的pH 比较稳定，SXG、SXS 采样点的TOC、TP、TN均高于SLD 采样点，说明SXG、SXS 采样点富营养化程度高于SLD 采样点，污染程度重，数据结果与实际环境一致，SLD 采样点位于东西连岛大沙湾浴场，属风景区，面向外海，潮间带为沙质；而SXG 采样点位于拦海大堤内侧，受港湾淤积和抛淤影响较大，潮间带为淤泥质；SXS 采样点位于西墅港湾，周围有碱厂、新城生活区，靠近水产养殖区，污染压力大，环境生态脆弱，底质为淤泥。

表2 沉积物理化因子检测结果

2.2 细菌总DNA 提取及16S rRNA 扩增

样品细菌总DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1，条带明显、单一、无降解。

图1 细菌总DNA 检测结果

2.3 细菌分类鉴定及群落结构组成

由图2 可知，3 个采样点细菌主要由变形杆菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）及其他（不确定）组成。从门水平看，变形杆菌门为优势菌群，占菌群总数的99.4%，其他种群仅占0.6%；SLD 采样点变形杆菌门占菌群总数的99.2%，SXG、SXS 采样点分别占菌群总数的99.8% 和99.1%；在属水平，SLD、SXS 和SXG 采样点的属平均值分别为24、34、32 个（表3），沉积物细菌在属水平上存在一定的差异。变形杆菌门中的弧菌属、交替假单胞菌属、红螺菌属和发光杆菌属的细菌为优势菌群，占菌群总数的94.6%。

图2 细菌群落组成

表3 细菌分类鉴定结果（单位：个）

根据获得的OTU 丰度矩阵，使用R 软件计算SLD、SXS 和SXG 3 个采样点共有OTU 数量（图3），3个采样点共有OTU 为170 个；SXG 采样点和SXS 采样点共有OTU 达96 个，SLD 采样点和SXS 采样点共有OTU 为18 个，SLD 采样点和SXG 采样点共有OTU为27 个，由于3 个采样点的地理位置比较近，表层沉积物中细菌组成具有一定的相似性。不同采样点的生境条件及潮间带底质又各有不同，SLD 采样点独有OTU 为37 个，远大于SXS、SXG 采样点，SXS 采样点和SXG 采样点潮间带为淤泥沙质，环境生态较一致，SLD 采样点为沙质潮间带，人类活动多，环境生态与SXS、SXG 采样点存在一定的差异性，表明沉积物细菌群落与环境因素密切相关。

图3 共有OTU 的Venn 图

2.4 细菌群落多样性和丰富度分析

由表4 得出丰富度指数和多样性指数（辛普森多样性指数、香浓-维纳多样性指数）的平均值。SLD 采样点：辛普森多样性指数为0.368 3，丰富度指数为133.190 6，香浓-维纳多样性指数为1.351 5；SXS 采样点：辛普森多样性指数为0.583 4，丰富度指数为170.261 7，香浓-维纳多样性指数为1.881 6；SXG 采样点：辛普森多样性指数为0.585 9，丰富度指数为169.362 3，香浓-维纳多样性指数为2.080 3。结果表明，细菌群落多样性和丰富度排序为SXG 采样点＞SXS 采样点＞SLD 采样点，该结论与样品采集点自然环境特征及污染状况一致。

表4 各样品的丰富度和多样性指数

2.5 细菌群落结构Beta 多样性分析

利用R 软件，对群落组成结构进行主成分分析（Principal component analysis，PCA），描述沉积物细菌群落结构Beta 多样性，如图4 所示。SLD1、SLD2、SLD3 与SXS1、SXS2、SXS3 明显归为2 个类群，与实际的样品采集点的地理分割及环境生态差异一致；而SXG3 与SXG1、SXG2 明显分在2 个区，虽然SXG3与SXG1、SXG2 同属墟沟海岸潮间带，但环境生态有明显差异。SLD1与SLD2、SLD3虽属同一相区，但距离较远，也存在差异，但相似性差异大于地理隔绝。

图4 细菌群落结构Beta 多样性主成分分析

此外，基于UniFrac 距离矩阵的细菌群落结构Beta 多样性聚类分析结果与主成分分析结果一致（图5）。

3 小结与讨论

3 个采样点的细菌主要由变形杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、酸杆菌门、梭杆菌门、疣微菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、绿弯菌门及其他（不确定）组成。本研究认为变形杆菌门为优势菌群，沉积物细菌在属水平上存在较大差异，变形杆菌门的弧菌属、交替假单胞菌属、红螺菌属、发光杆菌属的细菌为优势菌群，占菌群总数的94.6%。变形杆菌门的弧菌常常出现在水产养殖中，红螺菌、发光细菌是与赤潮发生有直接关联的细菌类群；交替假单胞菌占比较大，在自然界分布极广，能利用多种有机物，包括一些不能被其他细菌利用的有机物［11］；其他不确定种类表明潮间带细菌存在大量未知资源，有待进一步研究。

近海岸潮间带是人类和社会经济活动密集的区域，随着近海城市社会经济的快速发展，潮间带也面临养殖污染，如富营养化、陆地废源排放、填海围海工程及物质入侵等生态环境问题［9］。生态环境恶化主要表现为生物多样性的演替，特别是细菌对环境现状的敏感性，对其多样性及群落结构研究有重要意义。细菌群落多样性和丰富度的排序为墟沟采样点＞西墅采样点＞东西连岛采样点，墟沟采样点处于港湾内部，由于拦海大堤的建造，在墟沟港湾造成一定程度的淤积，再加上港口码头建造产生的抛淤，导致墟沟采样点完全是淤泥质；西墅采样点潮间带大部分为淤泥质，少数为沙质，加上靠近海水养殖区域，根据养殖方式、规模及海流影响呈现不同程度的富营养化，养殖污染的压力较大；而东西连岛采样点完全沙质，属于旅游景区，虽人类活动多，但面向外海，无抛淤及养殖污染压力，环境条件相对稳定，故墟沟采样点、西墅采样点细菌多样性和丰富度高于东西连岛采样点，本研究认为潮间带底质条件及理化因子的不同影响了细菌多样性和丰富度。细菌群落结构分布的差异能够反映人类活动及不合理人为干预造成的环境变化对生态系统产生的影响。

海洋环境中细菌群落具有多样性，不同环境中细菌组成具有异质性［12］，有研究表明，沉积物和海水之间细菌群落存在差异，Xia 等［13］通过主成分分析，发现黄河口沉积物与表层水体细菌组成差异较大，而高浓度悬浮物是造成二者差异的主要原因。孙凤芹等［14］从南海深海沉积物中分离获得349 株可培养细菌，芽孢菌属和变形杆菌属为优势菌群。刘玉娟等［15］从南海海洋沉积物样品中获得200 株可培养细菌，主要以厚壁菌门、变形菌杆门、放线菌门、拟杆菌门为主，在他们研究中都阐述了细菌群落多样性及结构组成与生态环境改变的同步性。本研究也认为3 个采样点的潮间带底质类型及理化因子的不同影响了细菌多样性及群落结构组成，至于某些特殊细菌对环境的适应性等尚需进一步探讨。