基于不同去袋期分析红皮梨花青苷合成酶及相关因子

张驰 穆凯代斯罕·伊萨克 吴俊杰 上杰 张琦

摘要：为探明不同去袋时期半红梨的果实品质表现及重要指标，明确参与调控半红梨着红色的关键酶，探讨果皮花青苷积累机制。以库尔勒香梨、新梨7号果实为试验材料，利用正交偏最小二乘判别分析、隶属函数法对果实品质进行综合评价并挖掘2个品种的重要指标；再利用动态网络热图明确调控半红梨着色的关键酶，并对花青苷积累的机制进行分析。结果表明，外在品质中去袋时间越晚2个品种果皮表面越光洁，效果越显著；而红度上新梨7号以不套袋最佳，香梨则以30 d去袋处理果实红度达到最高；2个品种b*则套袋处理的黄蓝指数均高于对照处理。套袋可减少果实质量，2个品种分别于采前25、20 d去袋处理硬度最低，分别为3.96、7.33 N；內在品质中维生素C含量2个品种均以采前15 d去袋处理含量最低，而其他各处理间均无显著性差异。新梨7号固酸比以采前25 d去袋最佳，而糖酸比则以对照组最高，为46.85；而香梨固酸比及糖酸比均在采前25 d进行去袋可以使果实香梨糖度达到最高。新梨7号所有处理蛋白质含量无显著性差异，而香梨以对照组最高，为0.127 8。套袋处理可降低新梨7号UFGT、DFR活性，CHS、CHI活性在采前30 d去袋达到最高，PAL活性在采前25 d去袋处理达到最高。香梨采前25～30 d去袋处理最好，在25 d之后会降低各酶的活性。新梨7号花青苷含量与CHI活性呈极显著正相关，香梨CHI活性和PAL活性呈显著正相关，2个品种花青苷合成关键酶活性都与可溶性糖、可溶性固形物含量呈显著正相关。综合比较香梨不推荐套袋，新梨7号以采前30 d解袋最佳。新梨7号花青苷合成关键酶为CHI，香梨花青苷合成关键酶是CHI、PAL。研究结果可为新疆红皮梨的适地适栽及选择优良品种提供理论依据。

关键词：香梨；新梨7号；去袋；综合品质；花青苷

中图分类号：S661.204  文献标志码：A  文章编号：1002-1302（2023）09-0147-07

基金项目：新疆生产建设兵团财政科技计划（编号：MSSS201903）。

作者简介：张 驰（1998—），男，新疆阿勒泰人，硕士研究生，主要从事果树栽培生理研究。E-mail：1030713591@qq.com。

通信作者：张 琦，硕士，教授，主要从事果树栽培生理生态方面的研究。E-mail：1041805650@qq.com。

果皮色泽是外观品质最直观的表现，但梨果实花青苷合成与积累规律较为复杂，不同种和品种果皮内花青苷浓度变化规律有所不同［1］，且同一品种在不同的生长环境条件下着色规律也不尽相同。加上栽培区域的光照、有效积温及温差，工人套袋技术以及去袋时间等，都可直接致使梨品质、着色效果等表现不一，都在不同程度上影响了市场竞争力。因此，探明不同相关合成酶促进红皮梨果实花青苷积累及了解红皮梨着色规律的机制，可为新疆红皮梨的适地适栽提供理论依据。我国学者通过对不同梨品种的着色生理研究，明确了部分梨品种的着色规律、相关代谢酶以及套袋等栽培措施促进果皮着色的作用等。如肖长城等对梨红色果皮的花青苷成分进行了分析［2］；占丽英等指出光照时间越长，对花青苷的合成越有利［3］；蓝光和紫外光对花青苷的合成最有效，可以有效提高促进植物呈色的酶活性；张雪等对早白蜜、中熟32及云红梨1号3个红皮梨品种不同成熟期果实进行研究，发现花青苷生物合成酶在不同的红皮梨品种中作用不尽相同，可溶性糖的积累对于花青苷的生物合成有一定的促进作用［4］。早白蜜花青苷合成的关键酶为查尔酮异构酶（CHI），而中熟32和云红梨1号苯丙氨酸解氨酶（PAL）与CHI只参与了花青苷的合成启动。冯守千等对2个砂梨品种进行套袋试验，表明套袋主要是调节了CHI的活性，进而影响了花青苷的合成。红色砂梨PAL、CHI活性变化趋势一致。但奥冠PAL活性低于满天红，CHI活性高于满天红［5］。Song等分析发现第4亚群R2R3 MYBs在花青素生物合成调控中发挥重要作用，PbMYB120被鉴定为花青素生物合成的潜在调控因子，在5个梨品种中表达量与花青素积累量呈正相关［6］。刘冰雁分析了苹果梨不同着色时期花青苷合成差异表达基因，并挖掘出花青苷合成中上调关键转录因子［7］。

然而我国现有研究对象大多为引进品种或极少数代表品种，对于我国特有梨资源品种研究匮乏，尤其是新疆红皮梨。因此，本研究以香梨与新梨7号等2个新疆特有红皮梨品种为试材。用化学计量学方法比较了2种梨品种中14项果实品质指标的定量变化，筛选出重要的指标物质。结合动态网络热图及花青苷合成途径，明确了红皮梨品种果皮着色的特点与差异、不同相关酶促进红皮梨果实花青苷积累的机制。以期为新疆红皮梨的适地适栽、生产推广及选择优良品种提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2021年在新疆塔里木大学梨种质资源圃进行取样，在南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室进行测定。

1.1 植物材料和冷处理

供试品种为新疆特有红皮梨新梨7号（Z）、香梨（C）。2个品种选取长势中等、产量较一致的6株盛果期树，于盛花期50 d后开始套袋，采前30、25、20、15 d进行去袋处理，以不套袋为对照；新梨7号编号为Z1、Z2、Z3、Z4、CK1，香梨编号为C1、C2、C3、C4、CK2。各品种果实每次采样以五点采样法在树冠各方位均匀随机釆样，每次各处理采30个果实，测得外在品质后，用手术刀剥取1.5 mm左右厚度果皮及果实酮部位置果肉，迅速液氮速冻后-80 ℃保存以供进一步分析。

1.2 果实指标测定

实验仪器由新疆力德汇科国际贸易有限公司、桂林量具刃具有限责任公司提供。纸袋为邓州尚源果业梨专用袋（外黄内黑双层套袋）［8］。

果实外在品质参照牛佳佳等的方法［9］进行测定：电子天平称量单果质量；电子数显游标卡尺测量纵横径，果形指数用纵横径比值表示；果实硬度用果实硬度计测量；果皮色泽采用色差计测量，测量直径为8 mm，照明为13 mm，以黑色、白色为标准颜色校准［9-10］。

果实内在品质：可溶性固形物含量（%）通过手持折光仪［11］进行测定；蛋白质采用考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue）法测定浓度。维生素C含量采用2，6-二氯靛酚滴定法［12］测定；可滴定酸含量参考牛佳佳等采用酚酞指示剂显色法［9］进行测定。

色素测定：叶绿素、类胡萝卜素含量采用混合液浸提法，分光光度计测定［13］。花青苷含量采用10 mL 1%盐酸甲醇溶液浸提法［14］测定。

1.3 花青苷合成酶测定

苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮异构酶（CHI）、查尔酮合成酶（CHS）、二氢黄酮醇还原酶（DFR）、类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶（UFGT）活性测定均采用酶联免疫吸附剂（ELISA）法测定，试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供。

1.4 统计分析

采用Origin 2021对生理数据进行统计分析，数据标准化；进一步利用SIMCA14.1进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，简称OPLS-DA），并采用投影重要变量VIP值法挖掘重要指标；最后用隶属函数法［计算公式如下：X（i）=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin），i=1，2，3，…，n。式中Xi表示第i个指标值，Xmax表示第i个指标的最大值，Xmin表示第i個指标的最小值；然后将隶属函数值进行累加并求平均数］对各项指标进行综合评价。果皮着色特点与差异、花青苷积累的机制分析则采用在线软件（https：//www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft）进行。

2 结果与分析

2.1 不同去袋时期果实品质分析

本研究对2个白梨品种进行了试验。在套袋后，2个品种的生理指标有明显差异。由表1可知，在外在品质上，套袋处理可以减少2个品种单果质量，且去袋时间越晚，果实质量越低；但果形指数中，新梨7号以对照组最低，而香梨则除采前15 d去袋高于对照处理外均低于对照处理。果实硬度中新梨7号、香梨分别在采前25、20 d去袋最软，分别为3.96、7.33 N，新梨7号采前25 d去袋处理显著低于其余处理；香梨采前20 d去袋处理显著低于采前30 d去袋处理。套袋可以提升果实的亮度指数L*，且果实去袋时间越晚其果实亮度越高，效果越显著；红绿指数a*：新梨7号以不套袋处理最高，套袋处理可抑制果皮红度，去袋时间越晚红度越低，20、15 d处理果皮均呈绿色；香梨在30 d去袋处理果实红度达到最高，但与不套袋处理差异不显著。套袋也可以提升果实的黄蓝指数b*，2个品种各套袋处理的黄蓝指数b*均高于对照处理，且新梨7号与香梨均以采前25 d去袋最高，分别为41.68和56.66。

由表2可知，套袋对2个品种的维生素C含量影响效果不大，2个品种均以采前15 d去袋处理含量最低，而其他各处理间均无显著性差异。新梨7号固酸比以采前25 d去袋最佳，而糖酸比则以对照组最高，为46.85；而香梨固酸比及糖酸比均以采前25 d去袋处理最高，在采前25 d进行去袋可以使果实香梨糖度达到最高。新梨7号所有处理蛋白质含量无显著性差异，而香梨以对照组最高，为 0.127 8，但与采前30、20、15 d去袋处理之间无显著差异。新梨7号不套袋处理叶绿素a、类胡萝卜素、花青苷含量均显著高于套袋各处理；套袋会显著抑制新梨7号3种色素的表达。香梨叶绿素a、叶绿素b、花青苷含量不套袋处理显著高于套袋各处理，类胡萝卜素含量则与30 d去袋处理无显著差异；香梨套袋会对叶绿素和花青苷含量产生抑制作用。

2.2 果实生理指标综合分析

利用OPLS-DA绘制模型得分图对2个梨品种的重要生理指标进行评价（图1-A）。以模型重要变量投影（VIP）值作为生理指标对引起组间差异的影响强度进行测量，筛选贡献较大的变量（以VIP值＞1为标准）：单果质量、a*、固酸比、糖酸比是2个红皮梨品种的重要生理指标。套袋处理下2个品种的指标有明显的变化，香梨与新梨7号的重要生理指标存在差异（图1-B、图1-C），套袋下香梨的重要生理指标为：单果质量、a*、L*和糖酸比；新梨7号的重要生理指标L*、固酸比、单果质量、糖酸比和a*。

2.3 果实品质综合评价

为比较全面地了解2个品种不同处理的果实品

质，本研究采用模糊数学中隶属函数法对10个处理进行综合评价，隶属函数平均值越大品质越高，反之越差（表3）。新梨7号综合评价排序为Z1＞CK1＞Z2＞Z3＞Z4，采前30 d去袋果实综合品质最好；香梨综合评价排序为CK2＞C1＞C2＞C3＞C4，不套袋处理最佳。

2.4 不同时期去袋对花青苷合成酶活性的影响

新梨7号不同时期去袋对花青苷各合成酶活性的影响存在明显差异。套袋处理对UFGT、DFR活性的抑制最为显著，去袋时间越晚其含量整体越低；说明光对UFGT、DFR活性的影响较大，光照时间越长其活性越高。而PAL活性在25 d去袋处理中达到最高，且30 d去袋处理、10 d去袋处理和不套袋处理差异不显著。CHS、CHI活性在30 d去袋处理中达到最高；CHS活性不套袋处理和其他处理没有显著差异，而CHI活性中除30 d去袋处理外，显著高于其他处理，CHS活性与CHI活性在采前 30 d 去袋可达到最佳值（表4）。香梨中，CHI及UFGT活性在30 d去袋处理中达到最高值，但与不套袋处理无显著差异；PAL与DFR活性在25 d去袋处理中达到最高值；CHS活性则以不套袋处理最高，但与30 d去袋处理差异不显著。香梨花青苷各合成酶以采前30 d去袋处理和不去袋处理活性较高，香梨套袋后在采前15～25 d去袋处理对花青苷各合成酶活性影响较大（表4）。

2.5 果实内在品质对花青苷及其合成酶的影响

由图2-A、图2-B可知，在果实着色中a*与花青苷含量极显著正相关，果皮中花青苷含量越高，其红色程度越深。内在品质中，可溶性糖与可溶性固形物含量与花青苷含量呈显著正相关，可溶性糖与可溶性固形物含量越多，花青苷的表达就越高。反之花青苷含量与叶绿素、类胡萝卜素、可滴定酸含量呈极显著负相关，其含量过高则会抑制花青苷的合成。

花青苷合成的5个相关酶中，CHI、PAL与香梨果皮花青苷含量呈极显著正相关，其次为UFGT、CHS，表明香梨花青苷合成关键酶为CHI与PAL。可溶性糖、可溶性固形物、维生素C含量与CHI活性呈极显著正相关，PAL活性则与可溶性固形物、维生素C含量呈极显著正相关；增加可溶性糖及维生素C的含量可以提高CHI的表达，进而有效增加果实红色程度。新梨7号花青苷合成关键酶为CHI，与花青苷含量呈极显著正相关；CHI活性与可溶性糖、可溶性固形物、维生素C含量呈极显著正相关，在果实着色期间可以适当喷施三者的外源物来增加CHI的表达进而促进果实着色。

3 结论与讨论

在新疆梨业生产上，套袋不仅可以有效调控果皮色泽，亦能改善梨果实的口感品质与营养品质［15］。史梦琪等对梨果套袋处理后，发现果面亮度和饱和度均有不同程度增加［16］。区善汉等研究表明，套袋可解决果皮着色差的问题并可以有效提高果面亮度、增加果面红绿色度和色泽饱和度［17］。本试验结果支持了套袋可改善果皮色差L、b*值增加着色效果的观点。而新梨7号套袋处理后a*仍以不套袋最佳，香梨采前30 d去袋处理与不套袋无明显差异。其原因可能与地区、温度、光照时间及强度或品种属性不同有关，而这一结果与王龙等研究结果一致，单独利用套袋技术不能显著改善果皮着红色［18］。

套袋能减少病虫害及果面的机械损伤等，提升果实内在品质［19］。姜晓艳等表明套袋对外观品质提高明显，可溶性固形物与可溶性糖含量变化较小，而可滴定酸含量显著降低［20］。于强等发现西洋梨品种套袋后外观品质、内在品质均有显著改善［21］，但Zeng等研究则发现，套袋果实中可溶性固形物、可溶性总糖含量和果肉硬度大多下降，而且固酸比增大［22］。本研究发现，套袋处理可以减少2个品种单果质量，果实硬度分别以采前25、20 d去袋处理最低；新梨7号果形指数以对照组最低，而香梨果形指数除采前15 d显著低于对照处理外，其余处理都与对照组无显著差异。套袋对维生素C含量影响不大；新梨7号固酸比以采前25 d去袋最佳，香梨也是；新梨7号糖酸比则以对照组最高，香梨在采前25 d进行去袋可以使果实糖度达到最高。与前人研究套袋可以提升可溶性糖、可滴定酸、可溶性固形物含量相似，Luo等研究发现套袋果实外观品质优于不套袋果实［23-24］。

套袋对花青苷合成的影响可分为2个阶段，套袋期显著抑制花青苷的合成，去袋后花青苷迅速合成。有研究明确表明，富丽和富吉2种苹果阳侧果皮中花青素含量分别是相应阴侧果皮的1.58倍和1.16倍［25］。夏静等研究发现，苹果在去袋后花青苷含量迅速上升，4 d后果皮花青苷含量开始超过对照水平，8 d超过对照处理1倍左右［26］。本试验发现，花青苷含量在去袋后虽然会有短期内的提升，但会逐渐趋于平稳，最终花青苷含量仍以不套袋最高；这与黄春辉等发现云红梨1号和美人酥去袋后花青苷含量急速上升，10 d后趋势变缓［27］，以及赵亚蒙等2年试验中，与对照相比套袋处理使单体花青苷含量降低了30.47%（2014年）和4.28%（2015年）的结果［28］一致。其原因可能是套袋是通过影响其他物质含量来间接影响花青苷含量，并不能直接作用于花青苷。如陈霞等研究发现，套袋果实去袋后是通过降低其中叶绿素含量，从而提高果皮色泽和着色面积［29］；李秀菊等研究了富士苹果套袋后果皮花青苷合成与内源激素含量变化的关系，表明套袋是从内源激素方面影响了花青苷的合成［13］。

花青苷合成途径中相关酶有苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶、查尔酮异构酶、二氢黄酮醇还原酶、类黄酮一糖基转移酶等［30］。这些酶相互协作，最终完成从花青苷合成前体苯丙氨酸到各种主要色素的合成和转化过程。有学者认为套袋处理抑制了紫草酚和花青素的生物合成，但促进了原花青素的积累［31］。Zhou等对Kyoho（V. labruscana）采用5种不同颜色袋子为对比，发现白色、绿色和黄色袋子可以显著增加香豆酰化和甲基化在花青苷中的比例［32］。Zhang等在试验中观察到采前覆膜和去袋2种处理在试验开始时均上调了UFGT、CHS基因的转录水平，而后DFR、LDOX和F3H的表达亦均有所增强；不套袋的果皮PAL活性呈下降趋势，而其他2个处理的果皮PAL活性先升高后降低［33］。本研究综合比较发现，套袋可抑制新梨7号UFGT、DFR活性；PAL活性对照处理除与20 d去袋处理有显著差异外，与其他处理无显著差异，CHS活性对照处理与各套袋处理无显著差异，CHI活性在30 d去袋处理有所增加，其余时间去袋处理均低于对照。在香梨中，套袋对PAL、CHI、UFGT活性影响不大，而CHS活性在20～25 d去袋活性会显著降低，而DFR活性在20～30 d内去袋均可以显著增加。

梨果实花青苷的合成途径是一个复杂的、多因素协同作用的过程，同品种甚至是同一品种的不同发育阶段、不同组织结构，这些酶的功能也可能会各不相同。张梦燕等研究发现，果皮中的花青苷积累量与其合成相关的PAL活性达显著水平［34］。杨俊枫等则认为PAL、UFGT是花青苷合成的关键酶［35］。而华星研究发现，花青苷含量与合成相关酶CHS、CHI、DFR、ANS的表达量呈极显著正相关［36］。本試验研究发现，新梨7号的花青苷含量与CHI表达量呈显著正相关，香梨花青苷含量则与CHI、PAL活性呈显著正相关，认为CHI是2个品种的共有关键酶，而香梨中PAL也是影响花青苷合成的关键酶。且2个红皮梨品种关键酶皆与可溶性糖、可溶性固形物含量呈显著正相关，与可滴定酸含量呈显著负相关。若对红皮梨品种增色则可以适当增加外源物或酸抑制剂来达到增加花青苷含量、增大果皮着红色面积的目的。

综合评价，新梨7号在采前30 d去袋可以使果实总品质达到最佳，香梨以对照处理表现最佳，不建议进行套袋处理。新梨7号是香梨的优质杂交后代，两者花青苷合成关键酶存在相似性与差异性，梨果皮花青苷合成关键酶为CHI、PAL，新梨7号为CHI；且两者均可以从提升果实可溶性糖和可溶性固形物含量，以及抑制类胡萝卜素、叶绿素、酸的表达这2个方面来促使果实颜色更加鲜艳。

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