HMGB1和RAGE在呼吸机相关性肺炎中作用的研究进展

黄绚丽，秘乐，徐宇，王红嫚

呼吸机相关性肺炎（ventilator associated pneumonia，VAP）是指机械通气（mechanical ventilation，MV）48 h后至拔管后48 h内出现的，以脓性气道分泌物、发热、呼吸窘迫并伴有肺部浸润影为特征的院内感染［1-2］。目前该病的治疗重点是预防性策略及经验性应用抗菌药，但效果甚微。近年来，随着新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在世界范围内大流行、呼吸机使用者数量增加，VAP患者的数量也在不断增加，危重患者的发病率甚至高达86%，给社会带来沉重的医疗和经济负担［3］。因此，探明VAP相关的病理机制，寻找有效的治疗靶点对阻止VAP的发生与发展具有重要的意义。炎症反应在VAP疾病进程中发挥着重要的作用，而高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）和晚期糖基化终产物受体（advanced glycation end-product receptor，RAGE）是炎症反应的关键介质，介导VAP的发生与发展。本文就HMGB1 和RAGE 及两者间关联在VAP中的作用及相关治疗进行综述。

1 VAP概述

VAP 的发病及发展机制复杂，除气管插管所致常见革兰阴性菌定植于下呼吸道外，其他危险因素包括潜在的危重疾病（如急性肺损伤、COVID-19、昏迷等）及各种干预措施（如长时间高潮气量通气、免疫麻痹、神经肌肉阻滞剂的使用、体外膜肺氧合等）使VAP 的发生发展复杂化，从而导致后期易并发呼吸窘迫、重度脓毒症、急性肾损伤等不良结局。其中，重度脓毒症是VAP死亡的主要原因之一，而“炎症反应的失控”被认为是各种潜在疾病下VAP 脓毒症发生的本质［4］。在VAP 的发生发展中，细菌等病原体相关分子模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）通过激活核转录因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），从而触发血液中白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、HMGB1等炎性因子大量表达，导致体内“炎症因子风暴”样效应，从而在人体对感染反应失调时导致危及生命的多器官功能障碍［5］。近年来，随着对该病研究的深入，抗生素、床头抬高、口腔护理等药物及措施已用于降低VAP 的病死率，但由于预防措施有限及细菌耐药性的产生，目前仍缺乏统一有效的治疗性干预手段来降低VAP 的病死率。减轻炎症反应可能是治疗及延缓VAP发生发展的关键措施。

2 HMGB1及其在VAP中的作用

2.1 HMGB1概述 HMGB1是一种非组蛋白的核蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中具有高迁移率而得名，人类HMGB1 由215 个氨基酸残基组成，分别形成功能显著的N 末端、HMG A 盒（第9～79 位氨基酸）、HMG B 盒（第95～163 位氨基酸）及C 端酸性尾巴（第186～215 位氨基酸），其中具有促炎活性的区域主要在B 盒，而A 盒具有抗炎作用，可作为HMGB1 拮抗剂［6］。HMGB1 因其位置的不同而发挥不同的功能，当机体内环境处于稳态时，HMGB1 主要存在于细胞核中，参与DNA的转录、翻译、染色质重塑及稳定核小体等；而当细胞受到外界“危险信号”刺激时，HMGB1 可通过发生乙酰化、甲基化、磷酸化或氧化还原等修饰后主动分泌到细胞外或凋亡/坏死后被动释放到细胞外环境中，直接作为炎性因子参与机体的先天性及适应性免疫反应［7］。

2.2 HMGB1 在VAP 中的作用 HMGB1 是VAP 发生发展的关键炎症介质。动物实验发现，超生理浓度的氧气能够损伤宿主的防御机制，增加宿主对铜绿假单胞菌（PA）等细菌的易感性，导致VAP 的发生。其机制一方面是高浓度的氧气损伤肺泡上皮细胞，使细胞外HMGB1 增加；另一方面，巨噬细胞外HMGB1 的升高可诱导高氧所致的线粒体超氧化物水平过高及锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的谷胱甘肽化，从而使巨噬细胞吞噬作用下降，HMGB1 等大量炎性因子的产生介导了VAP 发生及全身脓毒症的发展过程［8-9］。有研究发现，HMGB1、Toll样受体4（TLR4）、IL-6、IL-10 等炎性因子在高潮气量MV 组大鼠模型中高于正常潮气量组和对照组，随着HMGB1 表达量的增加及与其受体TLR4 的结合，进一步促进IL-6、IL-10、TNF-α、巨噬细胞炎性蛋白2（MIP-2）等炎性因子上调，促进肺部炎症的发生发展［10］。另有研究发现，中等潮气量MV 会促进脂多糖（LPS）诱导雄性SD 大鼠肺泡灌洗液（BALF）中HMGB1、IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-2 显著升高，HMGB1 与其他炎性因子呈显著正相关，抗HMGB1治疗可显著改善肺部的炎症损伤，表明HMGB1介导了MV加重LPS诱导的肺损伤；同时该研究小组行体外实验发现，HMGB1 在细胞循环拉伸中可通过p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和NF-κB 途径显著表达，进一步支持了体内实验结果［11］。

目前，众多的临床试验结果也与动物实验结果一致。van Zoelen 等［12］发现，长期MV 患者BALF 中HMGB1高于短期MV患者和健康志愿者，HMGB1的升高可能是促进VAP 发生发展的高危因素之一。另有研究发现，迟发型VAP 死亡患者血清HMGB1表达水平明显高于存活组，HMGB1 的升高可能是VAP 患者28 d 死亡的相关危险因素，可作为预测迟发型VAP 患者预后的可靠指标［13］。孙雪东等［14］也发现，VAP 早发组BALF 及巨噬细胞内HMGB1 的蛋白含量、TNF-α、IL-8 等炎性因子浓度低于VAP 晚发组；同时发现低水平HMGB1 患者7 d 撤机拔管率明显优于高水平HMGB1 患者，HMGB1 可作为预测VAP 患者预后的可靠指标。高秀莲等［15］发现，HMGB1、降钙素原（PCT）在MV 患者感染组中高于未感染组和健康对照组，而降钙素原基因相关肽则相反，三者联合在VAP 的早期诊断中具有一定的临床意义。综合以上结果可推测HMGB1 可能是介导VAP病理进程的关键炎症介质。

3 RAGE及其在VAP中的作用

3.1 RAGE 概述 RAGE 作为免疫球蛋白超家族成员，是一种炎症性Ⅰ型跨膜受体，广泛分布于内皮细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞等；而RAGE 受体在肺组织中表达最为丰富，分布于Ⅰ型肺泡细胞的基底外侧膜，介导Ⅰ型肺泡上皮细胞与基底层之间的连接。RAGE 作为多配体受体，既可以识别损伤相关分子模式分子（damage-associated molecular patterns molecules，DAMPs），如HMGB1、β 淀粉样蛋白、S100蛋白、补体蛋白C1q等，也可以识别PAMPs，如LPS、微生物DNA、呼吸道病毒等。在识别的DAMPs 中，HMGB1是RAGE亲和力最高的配体，负责炎性细胞内信号传导、趋化性和NF-κB 的激活，具有使中性粒细胞聚集、细胞因子释放等作用，是肺部炎症、内毒素血症及脓毒性休克的关键炎性因子［16-17］。

3.2 RAGE 在VAP 中的作用 可溶性RAGE（sRAGE）是RAGE 的异构体，由细胞膜上RAGE 的细胞外段裂解而来，可竞争性地与RAGE配体结合，阻断由RAGE启动的细胞内炎症反应及氧化应激反应。唐谨等［18］据28 d 生存情况将VAP 患者分为死亡组和存活组，发现死亡组外周血单个核细胞中RAGE mRNA、sRAGE、IL-6、PCT、TNF-α 水平显著升高，并认为sRAGE和PCT对于预测VAP患者的预后有很好的作用。张新月等［19］发现随着VAP 患者病情的加重，血浆sRAGE 水平代偿性地升高，同时还发现血浆sRAGE水平每增加一个单位，VAP患者预后不良的发生概率增加56%。

针对VAP 特殊的生理环境，目前仍缺乏动物及细胞实验论证RAGE 与VAP 之间的关系，但综合以上临床研究可推测RAGE在VAP的病理损伤过程中扮演着重要的角色，针对RAGE 靶点阻断与其配体的结合，可为临床诊治VAP 提供新思路，阻断其后期发展为脓毒症等不良后果。

4 HMGB1/RAGE与VAP

4.1 HMGB1/RAGE与炎症反应 在HMGB1的众多配体中，RAGE和TLR4是被广泛研究且促炎作用明确的配体，HMGB1的酸性尾巴、A盒与B盒的氨基酸与各种类型细胞（包括中性粒细胞、平滑肌细胞、单核细胞、癌细胞等）中RAGE 上的VC1 区域结合，激活炎性细胞信号通路，导致包括炎性因子在内的不同信号分子（如cdc42、p38、NF-κB 等）的产生，促使炎症反应的发生［17］。

4.2 HMGB1/RAGE 在VAP 中的作用 细菌感染是VAP 的直接致病原因，但VAP 危险因素众多［包括外伤、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等］，发病机制复杂，而HMGB1/RAGE在VAP 的发病及各危险因素中扮演着重要的角色，成为其发病机制中的关键物质。随着相关研究的不断深入，HMGB1/RAGE在介导VAP发生发展中的作用被更加明确地认识到。金黄色葡萄球菌（SA）及PA 是VAP 常见的致病菌，有研究者用SA 感染野生型小鼠，并在第6 h检测BALF发现HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子升高，同时伴随支气管炎、间质炎症、胸膜炎、内皮炎等急性病理性损伤；而相比TLR4 缺乏的小鼠，RAGE 缺乏小鼠BALF 中总蛋白水平未见明显变化，且肺组织炎症浸润区域减小，由此推测HMGB1/RAGE 介导了SA 引起的肺部炎症［20］。另有研究发现，在PA 导致的肺炎小鼠中，RAGE 缺陷小鼠白细胞募集、肺部炎症浸润面积及细菌生长减少，肺部症状减轻［21］。而另一研究则将小鼠暴露于高氧且同时感染PA，发现随着血液HMGB1的增加，中性粒细胞及白细胞吞噬活性明显降低，小鼠死亡率增加［9］。

针对宿主及干预危险因素而言，HMGB1/RAGE在VAP 的发生中也起着重要的作用。在挤压伤致肺泡上皮细胞凋亡的大鼠模型中发现，通过HMGB1/RAGE/JNK 信号通路的参与，大鼠被挤压3 h后损伤肌细胞产生的HMGB1被迅速释放到血液中，导致肺损伤在挤压伤后早期即出现，而阻断该信号通路可缓解肺泡上皮细胞的凋亡及细胞炎性因子的产生［22］。第2组先天淋巴细胞（ILC2）的扩增会导致肺部2 型炎性因子（包括IL-4、IL-13、IL-5 等）增加和嗜酸性粒细胞浸润，进而导致出血性休克后的肺损伤，而HMGB1 在出血性休克炎症期间通过与RAGE 结合，从而诱导ILC2 的增殖［23］。吸烟是COPD 最常见的危险因素，在烟雾的刺激下CD4/CD8 T 细胞、肺泡上皮细胞、中性粒细胞、肺泡巨噬细胞等炎症细胞受损，导致HMGB1从细胞核释放到细胞外，同时也可激活RAGE 启动子，从而促进RAGE表达，当HMGB1与RAGE结合时，可激活NF-κB 信号通路，进而诱导下游炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的持续释放，导致COPD 患者气道不可逆性梗阻［24］。HMGB1 可通过RAGE 介导LPS 进入细胞质，并激活胱天蛋白酶11（Caspase-11），从而诱导炎性因子的产生。有研究者将聚肌苷-聚胞苷酸［Poly（I：C）］滴入小鼠气管后以中等潮气量通气4 h发现，BALF 中的HMGB1 显著增加，而RAGE 缺陷小鼠Caspase-11受到明显抑制，减轻了MV对肺部的二次打击［25］。因此，可以推测HMGB1/RAGE贯穿于VAP的病因及各危险因素中，通过寻找针对HMGB1、RAGE 及HMGB1/RAGE 的阻断剂可为临床治疗VAP的肺部损伤及改善预后提供新思路。

4.3 HMGB1/RAGE 相关抑制剂 在抑制HMGB1/RAGE 引发的炎症过程中，目前已出现许多针对性的阻断剂。在小鼠脓毒性脑病的研究中发现，小檗碱可阻断HMGB1/RAGE信号，从而抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，减少补体蛋白C1qA、IL-1α、TNF-α 的释放，进而改善小鼠的认知功能［26］。甘草甜素可通过抑制HMGB1/RAGE/NF-κB 信号传导，从而抑制随后的促炎细胞因子表达、神经炎症、创伤性脑损伤及多发性硬化症等疾病的发展［27］。在大鼠创伤性脑病模型中也进一步证实了甘草甜素可阻止HMGB1 在体内与RAGE 结合，完全抑制了IL-6、TNF-α 及IL-1β 在损伤部位的表达，从而改善大鼠的运动和认知功能障碍［28］。右美托咪定可抑制HMGB1/RAGE/NF-κB 信号传导及随后的神经炎症［29］。在创伤性脑损伤引起的小鼠急性肺损伤模型中也证实，右美托咪定可下调血清HMGB1和肺组织RAGE 的表达［30］。α7 烟碱型乙酰胆碱受体（α 7nAChR）调节剂GTS-21 及其新型α7nAChR 调节剂GAT107 可通过定向线粒体途径减少高乙酰化和氧化来抑制细胞核内的HMGB1释放，从而降低高氧所致VAP 的发生风险［8］。而通过糖胺聚糖GM-1111修饰的透明质酸可以抑制细胞外HMGB1 的作用及其下游炎症信号，从而改善体内先天免疫防御功能［31］。依他尼酸则通过抑制高氧诱导的NF-κB 活化，下调HMGB1的表达来增强巨噬细胞的吞噬活性和迁移能力［32］。N-苄基-4-氯-N-环己基苯甲酰胺（FPS-ZM1）可通过与RAGE 的V 区域结合，影响HMGB1 与RAGE 的相互作用，在新型冠状病毒（SARS-CoV-2）诱导的小鼠肺炎模型中，预先应用FPS-ZM1可使小鼠存活率明显升高［33］。此外，藏红花素、姜红素、氯胺酮、替米沙坦、厄贝沙坦和坎地沙坦等HMGB1/RAGE 阻断剂也被证实在各种急慢性炎症中有治疗效果［34-37］。但在目前VAP的临床诊疗中尚鲜见针对阻断HMGB1/RAGE 拮抗剂疗效的相关报道，可见该方向还具有广阔的探索空间。

5 小结与展望

HMGB1/RAGE 在VAP 的病因及各种危险因素中扮演着重要的角色，HMGB1通过与RAGE结合诱导下游炎症信号通路的激活，刺激大量炎性因子释放，各种炎性因子恶性循环、相互作用，最终导致VAP 的肺部损伤及后期脓毒症等并发症，但HMGB1/RAGE 在VAP 及后期并发症中的作用仍需进一步阐明。HMGB1/RAGE 在各种动物炎症模型中已有显著成效，但临床研究仍未见明显进展。因此，进一步明确HMGB1/RAGE 在VAP 中的作用，以及开发有效的新型HMGB1/RAGE 拮抗剂可能在VAP的临床诊疗中提供更多选择。