质谱导向的肾指海绵Reniochalina sp.中环肽类成分研究

吴宗梅，吴 莹，张帅帅，孔 灿，王淑萍，林厚文 （.上海交通大学医学院附属仁济医院药学部, 上海007；.沈阳药科大学中药学院, 辽宁 沈阳 006；.齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所, 山东 济南 500）

肾指海绵属（Reniochalina）海绵为寻常海绵纲（Demospongiae）软海绵目（Halichondrida）小轴海绵科（Axinellidae）的海洋多细胞动物。目前，针对该属海绵进行的化学成分研究主要包括甾类[1]、低极性化合物（如脂肪酸类、邻苯二甲酸类、烃类）[2]、炔醇[3]和环肽[4]等类型。其中，环肽reniochalistatins A-E 由我们课题组获得，而环八肽reniochalistatin E 因对人骨髓瘤细胞RPMI-8 226 的IC50值为4.90 μmol/L，已有两个团队采用不同策略对其完成全合成[5-6]。

为进一步高效挖掘肾指海绵中的潜在新型活性环肽，课题组基于环肽类化合物质谱响应度好，灵敏度高，二级质谱中存在明显的氨基酸单元碎裂的b 和y 特征离子，以质谱为导向，继续追踪分离该属海绵中的环肽类成分。最终，分离鉴定了3 个环七肽（图1），并对它们进行了初步细胞毒活性评价。

图1 化合物1 ～ 3 的化学结构

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

600、700 MHz 核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；Xevo G2-XS QTOF 质谱仪（美国Waters 公司）；质谱引导的自动纯化系统（美国Waters 公司）；Acquity UPLC 高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Interchim PuriFlash 450 中压色谱仪（法国Interchim 公司）；SK5200H 型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；BT224S 电子天平（德国Sartorius公司）；EYELAN-1 000 型旋转蒸发仪（日本东京理化公司）；低温高速离心机（美国Thermo Fisher 公司）；XBridge C18半制备型液相色谱柱（10 mm ×250 mm, 5 μm，美国Waters 公司）；ODS 柱色谱填料（日本YMC 公司）；Sephadex-LH20 柱色谱填料（瑞典Pharmacia 公司）；色谱级试剂（德国Merck公司）；分析纯试剂（上海化学试剂公司）；氘代试剂（美国Cambridge Isotope 公司）。

1.2 海绵样本

海绵样本由课题组颜益珍老师于2021 年4 月采集自中国南海永乐群岛附近海域（25～30 m 深度）。样本呈橙黄色，质地较硬。经课题组杨琪博士鉴定为Reniochalina属海绵。凭证标本（编号：212604）现保存于上海交通大学医学院附属仁济医院海洋药物实验室。

1.3 分步萃取

将干重78.5 g 的海绵剪碎成块，先后加入等体积甲醇、二氯甲烷-甲醇（V/V= 1∶1）分别超声提取3～5 次，每次30 min，合并提取液经减压浓缩得粗提物23.7 g。先将粗提物混悬于90%的甲醇水中，用等体积石油醚萃取3～5 次，再将90%的甲醇水层加水稀释至60%，用等体积二氯甲烷萃取3～5 次，合并萃取液经减压浓缩得二氯甲烷层浸膏1.2 g，其经LC-MS 分析确认富含潜在的大分子量环肽。而60%的甲醇水层稀释至30%后再用乙酸乙酯萃取，经LC-MS 检测已无大分子量环肽。故通过质谱导向的分步萃取，潜在的大分子量环肽主要分布于二氯甲烷层。

1.4 追踪分离

基于环肽类化合物分子量大的特点，通过两次Sephadex LH-20 凝胶柱色谱分离，并采用质谱定位追踪的方式将潜在环肽富集。第一次以二氯甲烷-甲醇（V/V= 1∶1）为洗脱剂，二氯甲烷层浸膏经凝胶柱色谱分离得到组分Fr.A ～ Fr.C。第二次以正己烷-二氯甲烷-甲醇（V/V/V= 4∶5∶1）为洗脱剂，富含潜在大分子量环肽的Fr.B 经凝胶柱色谱分离得到亚组分Fr.B1 ～ Fr.B5。其中，Fr.B2 ～Fr.B4 先后经中压ODS 柱色谱分离（紫外监测波长设为210 nm，以甲醇-水为流动相，以流速15 ml/min在10 h 内梯度洗脱10% ～ 100%），通过质谱定位追踪分别获得一系列精细组分。

上述精细组分经质谱引导的自动纯化系统制备获得环肽单体。质谱条件：质量扫描范围m/z100～1 250，锥孔电压 15 V，ES+模式下扫描采集数据。色谱条件：以半制备型C18柱为固定相，以乙腈-水（含0.1% 甲酸）为流动相，以流速6 ml/min进行梯度洗脱。其中，Fr.B2-27 在32 min 内线性梯度洗脱40%～48%获得化合物1（2.7 mg,tR=21 min）；Fr.B4-5 在52 min 内线性梯度洗脱20%～23%获得化合物2（3.3 mg,tR=36 min）；Fr.B2-11 在32 min 内线性梯度洗脱30%～40%获得化合物3（3.4 mg,tR=18 min）。

2 结构鉴定

化合物1：无色结晶固体，茚三酮显色阴性。HRESIMS 给出准分子离子峰m/z768.466 1 [M+H]+(calcd 768.466 0)，确定其分子量为767。结合1H 和13C-NMR 谱确定其分子式为C40H61N7O8，计算不饱和度为14。1D NMR 谱图给出典型的肽类化合物特征信号。其中，1H NMR 谱显示有5 个低场区的酰胺氨基质子信号(δH9.45, 8.90, 8.71, 7.23,7.16)，7 个α-次甲基质子信号(δH4.69, 4.32, 4.16,4.12, 4.03, 3.89, 3.51)。13C NMR 谱提示有7 个酰胺羰基碳信号(δC171.6, 171.1, 170.9, 170.8, 170.6,169.6, 168.5)，7 个α-次甲基碳信号(δC60.7, 60.6,59.2, 55.4, 55.1, 55.0, 54.1)。由此推断该化合物可能为七肽。结合2D NMR 谱图，确定该七肽由两个脯氨酸残基、一个亮氨酸残基、两个异亮氨酸残基、一个苯丙氨酸残基和一个丝氨酸残基组成。残基连接顺序由HMBC、ROESY 相关信号和ESIMS/MS 质谱数据确定，绝对构型由高级Marfey 法确定[7-8]。综上，该化合物结构为cyclo-(L-Pro-L-Ser-L-Phe-L-Ile-L-Leu-L-Pro-L-Ile)。将核磁共振数据归属如下：1H NMR (700 MHz, DMSO-d6)δH9.45 (1H,d,J= 8.4 Hz, 36-NH), 8.90 (1H, br s, 7-NH), 8.71(1H, d,J= 6.6 Hz, 25-NH), 7.23 (1H, d,J= 10.3 Hz,19-NH), 7.16 (1H, d,J= 4.8 Hz, 10-NH), 7.31 (2H,d,J= 7.5 Hz, H-13, H-17), 7.25 (2H, t,J= 7.5 Hz, H-14, H-16), 7.20 (1H, t,J= 7.3 Hz, H-15), 4.69 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-2), 4.39 (1H, m, H-34a), 4.32 (1H, dd,J= 11.0, 8.4 Hz, H-36), 4.16 (1H, m, H-10), 4.12(1H, t,J= 10.5 Hz, H-19), 4.03 (1H, t,J= 7.8 Hz, H-31), 3.89 (1H, t,J= 7.1 Hz, H-7), 3.57 (1H, m, H-34b), 3.51 (1H, m, H-25), 3.50 (1H, m, H-5a), 3.49(1H, m, H-8a), 3.47 (1H, m, H-8b), 3.36 (1H, m, H-5b), 3.13 (1H, dd,J= 13.1, 2.8 Hz, H-11a), 2.84 (1H,dd,J= 13.0, 9.5 Hz, H-11b), 2.38 (1H, m, H-3a), 2.18(1H, td,J= 12.7, 4.3 Hz, H-26a), 2.08 (1H, m, H-32a), 2.05 (1H, m, H-37), 2.01 (1H, m, H-33a), 1.92(1H, m, H-3b), 1.90 (1H, m, H-4a), 1.79 (1H, m, H-33b), 1.73 (1H, m, H-32b), 1.55 (1H, m, H-26b), 1.53(1H, m, H-39a), 1.52 (1H, m, H-4b), 1.43 (1H, m, H-20), 1.42 (2H, m, H-22a, H-27), 1.15 (1H, m, H-39b),1.09 (1H, m, H-22b), 0.87 (3H, m, H-21), 0.85 (3H,m, H-29), 0.83 (6H, m, H-23, H-38), 0.82 (3H, m, H-28), 0.75 (3H, t,J= 7.3 Hz, H-40)；13C NMR (175 MHz, DMSO-d6)δC171.6 (C-30), 171.1 (C-35),170.9 (C-9), 170.8 (C-1), 170.6 (C-24), 169.6 (C-18),168.5 (C-6), 136.9 (C-12), 129.9 (C-13, C-17), 127.9(C-14, C-16), 126.4 (C-15), 60.7 (C-31), 60.6 (C-2,C-8), 59.2 (C-19), 55.4 (C-7), 55.1 (C-10), 55.0 (C-36), 54.1 (C-25), 48.2 (C-34), 46.3 (C-5), 37.0 (C-11,C-26), 36.7 (C-20), 34.8 (C-37), 30.8 (C-3), 29.4 (C-32), 24.7 (C-27, C-33), 24.2 (C-22), 23.9 (C-39), 23.2(C-29), 22.2 (C-4), 20.8 (C-28), 14.9 (C-40), 14.5 (C-23), 10.1 (C-38), 9.5 (C-21)。以上数据与文献[9]基本一致，故将化合物1 鉴定为stylopeptide 1。

化合物2：无色无定形粉末，茚三酮显色阴性。HRESIMS 给出准分子离子峰m/z770.410 2[M+H]+(calcd 770.408 9)，确定其分子量为769。结合1H 和13C-NMR 谱确定其分子式为C38H55N7O10，计算不饱和度为15。1D NMR 谱图给出典型的肽类化合物特征信号。其中，1H NMR 谱显示有5 个低场区的酰胺氨基质子信号(δH8.77, 8.43, 8.33,8.03, 7.55)，7 个α-次甲基质子信号(δH4.53, 4.38,4.34, 4.28, 4.05, 4.03, 3.99)。13C NMR 谱 提 示 有7 个酰胺羰基碳信号(δC172.6, 172.4, 170.6, 170.5,170.3, 170.0, 169.9)，7 个α-次甲基碳信号(δC62.5,60.4, 57.5, 56.9, 51.6, 49.9, 47.4)。据此推断该化合物可能为七肽。结合2D NMR 谱图，确定该七肽由两个脯氨酸残基、一个亮氨酸残基、一个酪氨酸残基、一个天冬氨酸残基、一个丙氨酸残基和一个异亮氨酸残基组成。残基连接顺序由HMBC、ROESY 相关信号和ESI-MS/MS 质谱数据确定，绝对构型由高级Marfey 法确定。综上，该化合物结构为cyclo-(L-Pro-L-Asp-L-Tyr-L-Pro-L-Ile-L-Ala-LLeu)。将核磁共振数据归属如下：1H NMR (700 MHz, DMSO-d6)δH8.77 (1H, br s, 31-NH), 8.43(1H, d,J= 7.5 Hz, 11-NH), 8.33 (1H, br s, 25-NH),8.03 (1H, s, 7-NH), 7.55 (1H, d,J= 6.5 Hz, 34-NH),6.97 (2H, d,J= 8.1 Hz, H-14, H-18), 6.66 (2H, d,J=8.1 Hz, H-15, H-17), 4.53 (1H, m, H-7), 4.38 (1H, m,H-31), 4.34 (1H, m, H-20), 4.28 (1H, d,J= 7.5 Hz,H-34), 4.05 (1H, m, H-11), 4.03 (1H, m, H-2), 3.99(1H, m, H-25), 3.63 (1H, m, H-5a), 3.56 (1H, m, H-5b), 3.26 (2H, m, H-8a, H-23a), 2.99 (1H, m, H-12a),2.88 (1H, m, H-12b), 2.83 (1H, m, H-8b), 2.59 (1H,m, H-23b), 2.22 (1H, m, H-3a), 2.10 (1H, m, H-21a),1.87 (1H, m, H-4a), 1.77 (1H, m, H-4b), 1.68 (1H, m,H-35a), 1.67 (2H, m, H-21b, H-26), 1.58 (1H, m, H-35b), 1.57 (1H, m, H-3b), 1.55 (1H, m, H-36), 1.54(1H, m, H-22a), 1.53 (1H, m, H-28a), 1.24 (1H, m, H-22b), 1.16 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-32), 1.10 (1H, m, H-28b), 0.86 (3H, d,J= 5.8 Hz, H-37), 0.82 (3H, m, H-38), 0.80 (6H, m, H-27, H-29);13C NMR (175 MHz,DMSO-d6)δC172.6 (C-1), 172.4 (C-24), 172.1 (C-9),170.6 (C-19), 170.5 (C-10), 170.3 (C-6), 170.0 (C-33), 169.9 (C-30), 155.9 (C-16), 129.6 (C-14, C-18),127.8 (C-13), 115.1 (C-15, C-17), 62.5 (C-2), 60.4(C-20), 57.5 (C-31), 56.9 (C-34), 51.6 (C-7), 49.9 (C-11), 47.4 (C-25), 47.0 (C-5), 45.7 (C-23), 40.4 (C-35), 36.1 (C-8), 35.4 (C-12, C-26), 30.4 (C-3), 29.5(C-21), 25.1 (C-4), 24.7 (C-36), 24.3 (C-28), 22.9 (C-37), 21.4 (C-38), 20.9 (C-22), 15.1 (C-32), 14.9 (C-29), 10.9 (C-27)。以上数据与文献[10]基本一致，故将化合物2 鉴定为hymenamide D。

化合物3：无色无定形粉末，茚三酮显色阴性。HRESIMS 给出准分子离子峰：m/z767.446 8[M+H]+(calcd 767.445 6)，确定其分子量为766。结合1H 和13C-NMR 谱确定其分子式为C39H58N8O8，计算不饱和度为15。1D NMR 谱图给出典型的肽类化合物特征信号。其中，1H NMR 谱显示有5 个低场区的酰胺氨基质子信号(δH8.80, 8.13, 7.98,7.95, 7.25)，7 个α-次甲基质子信号(δH4.65, 4.28,4.24, 4.19, 4.14, 3.89, 3.83)。13C NMR 谱 提 示 有7 个酰胺羰基碳信号(δC171.4, 171.1, 170.9, 170.3,170.2, 170.1, 169.6)，7 个α-次甲基碳信号(δC62.3,61.5, 60.2, 57.1, 55.2, 51.0, 49.3)。据此推断该化合物可能为七肽。结合ESI-MS/MS 质谱数据确定其氨基酸残基组成为两个脯氨酸残基、一个亮氨酸残基、一个苯丙氨酸残基、一个天冬酰胺残基和两个缬氨酸残基，残基连接顺序为cyclo-(Pro-Asn-Val-Pro-Leu-Val-Phe)。通过高级Marfey 法确定所有氨基酸残基均为L 构型。将核磁共振数据归属如下：

1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δH8.80 (1H, d,J=5.4 Hz, 21-NH), 8.13 (1H, d,J= 9.5 Hz, 32-NH),8.01 (1H, s, 9-NH2), 7.98 (1H, d,J= 8.5 Hz, 11-NH),7.95 (1H, d,J= 6.1 Hz, 7-NH), 7.28 (1H, m, 9-NH2),7.25 (3H, m, 27-NH, H-35, H-39), 7.18 (1H, d,J=7.4 Hz, H-37), 7.14 (2H, d,J= 7.6 Hz, H-36, H-38 ),4.65 (1H, m, H-7), 4.28 (1H, d,J= 7.7 Hz, H-32),4.24 (1H, m, H-16), 4.19 (1H, m, H-21), 4.14 (1H, t,J= 8.6 Hz, H-27), 3.89 (1H, t,J= 8.6 Hz, H-2), 3.83(1H, t,J= 7.9 Hz, H-11), 3.75 (1H, m, H-5a), 3.46(2H, m, H-5b, H19a), 3.26 (1H, m, H19b), 3.06 (1H,m, H-8a), 2.94 (3H, m, H-8b, H33a, H33b), 2.34 (1H,m, H-17a), 2.19 (2H, m, H-3a, H12), 2.02 (1H, m, H-28), 1.96 (1H, m, H-18a), 1.85 (1H, m, H-4a), 1.71(2H, m, H-18b, H-23), 1.61 (1H, m, H-22a), 1.46(1H, m, H-4b), 1.23 (1H, m, H-17b), 1.19 (1H, m, H-22b), 0.99 (1H, m, H-3b), 0.92 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-13), 0.89 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-14), 0.86 (6H, d,J=6.7 Hz, H-29, H-30), 0.84 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-25),0.79 (3H, d,J= 6.4 Hz, H-24);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δC172.5 (C-9), 171.4 (C-26), 171.1 (C-20), 170.9 (C-31), 170.3 (C-1), 170.2 (C-15), 170.1(C-10), 169.6 (C-6), 138.4 (C-34), 128.9 (C-35, C-39), 128.1 (C-36, C-38), 126.2 (C-37), 62.3 (C-2),61.5 (C-11), 60.2 (C-16), 57.1 (C-27), 55.2 (C-32),51.0 (C-21), 49.3 (C-7), 47.6 (C-5), 45.8 (C-19), 37.9(C-22), 37.0 (C-33), 35.5 (C-8), 30.5 (C-17), 30.1 (C-28), 29.5 (C-12), 29.2 (C-3), 25.1 (C-4), 24.2 (C-23),23.3 (C-24), 21.3 (C-18), 20.6 (C-25), 19.7 (C-13),18.7 (C-14, C-29), 18.3 (C-30)。以上数据与文献[11]基本一致，故将化合物3 鉴定为axinastatin 2。

3 活性测试

采用CCK-8 法初步评估化合物对6 种人肿瘤细胞株（A2780、HCT-8、HepG2、NCI-H460、SW480、PC-9）的体外细胞毒活性。主要步骤为：取对数生长期的细胞制成细胞悬液，约4×103个细胞/孔接种至96 孔板内，每组设3 个复孔。过夜培养后，各株细胞分别加入20 μmol/L 化合物，并设对照组（顺铂）和空白组（DMSO），继续孵育48 h。随后，避光情况下每孔加入10 μl CCK-8 溶液。孵育0.5 ～ 2 h后，450 nm 处测其吸光度，每株细胞测3 次以上，并计算其细胞活力（%）。对于肿瘤细胞生长抑制率大于50%的化合物，进一步测试其活性剂量依赖关系。结果显示，化合物1 对NCI-H460、HepG2、PC-9、HCT-8、A2780 和SW480 均具细胞毒性，IC50值分别为6.09、9.31、13.24、14.31、14.38 和17.26 μmol/L。

4 讨论

环肽具有许多独特的生化和治疗特性，目前已有抗生素类达托霉素、止痛剂齐考诺肽、抗肿瘤药帕瑞肽等环肽类药物获批用于临床[12]。海绵是环肽类化合物的重要多产来源，然而，其体内环肽因含量低微、紫外吸收不佳、核磁灵敏度差等，特异识别和定向获取极富挑战。将质谱高灵敏度、高准确度和高选择性的技术优势与环肽独特的质谱碎裂模式有机结合，有助于提高环肽发现的通量和选择性。

本研究以质谱为导向，追踪分离肾指海绵中的潜在新颖活性环肽，分离鉴定出3 个环七肽，它们均为首次从该属海绵分离获得。此外，本研究还发现化合物1 对多种人肿瘤细胞株具有中等抑制活性。而有趣的是，早期由George R.Pettit 课题组分离获得的源于Stylotella属和Phakellia属海绵的同一化合物1，其抑制P388 小鼠白血病细胞生长的能力却相差十倍以上[9,13]。这可能与天然来源环肽能与某些仅生物方法才能检测到的微量强活性抗肿瘤物结合[9,13]，或不同溶剂环境致使环肽分子构象发生改变有关[14]。化合物2 先后发现于Hymeniacidon属[10]和Stylissa属[15-16]海绵，对多种肿瘤细胞株开展的活性试验显示其无明显细胞毒性。化合物3此前发现于Axinella属海绵，其对小鼠P388 细胞和一系列人肿瘤细胞具有较强的体外细胞毒性[11]。

不同种属的海绵能够产生相同类型的环肽分子，同一类型的环肽分子表现出不同的细胞毒活性，可能和与海绵共生互作的微生物相关。本研究进一步丰富了肾指海绵中环肽类化合物的多样性，也为研究特征结构类型的海洋天然产物提供了新思路、新方法。