液相色谱-三重四极杆串联质谱结合QuEChERS测定牛百叶中五氯酚酸钠的含量

潘明迪

摘 要：目的：建立液相色谱-三重四极杆串联质谱仪测定牛百叶中五氯酚酸钠含量的方法。方法：样品通过QuEChERS前处理进行提取与净化，以乙酸铵水溶液+甲醇为流动相梯度洗脱，多反应监测，负模式扫描，外标法定量。结果：目标化合物在0～80.0 ng·mL-1具有良好线性关系，检出限为0.3 μg·kg-1，定量低限为0.5 μg·kg-1，平均回收率为90.2%～98.3%，RSD在1.3%～2.2%。结论：该方法准确、稳定，可用于牛百叶中五氯酚酸钠测定。

关键词：畜牧副产品；五氯酚酸钠；检测

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of sodium pentachlorophenate in bovine louver by liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry. Method： The samples were extracted and purified by QuEChERS pretreatment. Ammonium acetate aqueous solution + methanol was used as mobile phase gradient elution， multi-reaction monitoring， negative mode scanning， and quantitative by external standard method. Result： The target compounds showed good linearity in the concentration range of 0 to 80.0 ng·mL-1. The detection limit was 0.3 μg·kg-1， and the quantization limit was 0.5 μg·kg-1. The average recoveries were 90.2%～98.3%， RSD were 1.3%～2.2%. Conclusion： The method is accurate and stable， and can be used for the determination of sodium pentachlorophenolate in bovine louver.

Keywords： livestock by-products; sodium pentachlorophenate; testing

五氯酚酸及其钠盐因低成本成为新的杀虫剂、除草剂真菌灭除剂。生长在高有机质含量的酸性土壤的植物可将其富集进入食物链，产生内分泌毒素干扰生物遗传、细胞生长发育等。我国原农业部于2002年发布的235号和250号公告，将五氯酚酸钠列为违禁药物，不得使用。目前食品样本中五氯酚酸及其钠盐的检测方法主要有液相色谱[1]、气相色谱[2]、液相色谱质谱联用[3]和气相色谱质谱联用[4-5]等技术。现行标准中多采取固相萃取前处理方法，对于五氯酚酸钠有很好的富集作用，但耗时长，需要专用装置，分析效率低，不利于大量分析作业。

分散固相萃取与固相萃取原理相近，样品中的杂质与加入的吸附剂相互作用从而达到净化样品目的，常见于植物源性食品中多种农药残留的检测。当前动物源性食品中的五氯酚酸钠的分散固相萃取方法研究相对较少，本文拟建立一种简单、便捷的分散固相萃取方法结合超高液相色谱三重四极杆联用质谱应用于动物源性食品中五氯酚酸钠定量，使前处理时间缩短、提高效率、降低成本。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

牛百叶购自本地麻辣烫店，火锅店及农副产品超市。

甲醇中五氯酚酸钠溶液标准物质（1 00 μg·mL-1），陕西秦境标准物质科技中心；甲醇、乙腈与甲酸（色谱级），美国赛默飞世尔科技有限公司；乙酸铵（色谱级），天津科密歐；三乙胺（优级纯），国药集团；实验用一级水（美国赛多利斯超纯水机）；方法验证遵循《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）。

1290-6420高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪（配ESI源，美国Agilent公司）；JXFSTPRP-192型高速组织研磨均质仪（拓赫机电科技有限公司）；NEORUGE-23R型低温冷冻高速离心机（力康生物医疗科技有限公司）；QuEChERS试剂包（含萃取管、盐包及净化管，北京普立泰科仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 提取

取200 g可食用部分的牛百叶，剪成小块后用高速组织研磨均质仪进行均质，放入塑料干净的容器中。称取匀质后试样2.00 g置于QuEChERS样品前处理包中附带的50 mL提取管中，加入80%乙腈溶液20 mL，涡旋振荡3 min后加入前处理提取盐包，再次涡旋3 min，在2 ℃条件下，以6 500 r·min-1离心10 min，取10 mL上清液置QuEChERS净化管中，涡旋3 min，2 ℃条件下，以6 500 r·min-1离心10 min后准确移取10 mL上清液转移至QuEChERS样品前处理包中附带的15 mL离心管中待净化。

1.2.2 净化

QuEChERS样品前处理包中附带的15 mL离心管（下称净化管）中含有分散净化剂，无需再加入其他试剂。将15 mL净化管涡旋振荡3 min，在2 ℃条件下，以6 500 r·min-1离心10 min后将管中上清液全部转移至干净离心管中，在45 ℃低速氮气下浓缩至近干，用50%的甲醇定容至1 mL，过0.22 ?m有机系微孔滤膜，上机测定。

1.2.3 基质匹配标准工作溶液的配制

吸取1 00 μg·mL-1五氯酚酸钠标准物质0.5mL于50.0 mL容量瓶中，甲醇定容，配成1 μg·mL-1五氯酚酸钠标准物质储备液。然后用50%甲醇配成以下浓度的五氯酚酸钠标准溶液系列，即0 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1和800 ng·mL-1。取2022年国家食品安全监督抽检已检测过合格的阴性样品8份，每份2.00 g，按照步骤1.2.1提取、1.2.2净化（不需氮吹浓缩），得到空白基质溶液8份。吸取五氯酚酸钠标准溶液系列点各100 μL于干净的15 mL离心管中，分别用空白基质溶液定容至1.0 mL，得到浓度为0 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和80.0 ng·mL-1的五氯酚酸钠基质匹配标准工作溶液，另用50%甲醇替代空白基质，配制与五氯酚酸钠基质匹配标准工作溶液同浓度的8个点，作为五氯酚酸钠溶剂标准工作溶液。

1.2.4 色谱质谱条件

（1）色谱条件。色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；流动相：A为甲醇、B为5 mmol·L-1乙酸铵溶液；流速：0.3 mL·min-1；进样量：10 μL；梯度洗脱：0～1.50 min，50%→100%A；1.51～3.00 min，100%A；3.01～5.00 min，50%A。

（2）质谱条件。离子源：ESI-，多反应监测（MRM）模式；裂解电压：135 V；碰撞气能量：-35 V；定量离子对（m/z）：264.7＞264.7；定性离子对（m/z）：264.7＞264.7、264.7＞262.7、264.7＞266.7，264.7＞268.7。

2 结果与分析

2.1 提取、净化条件优化

2.1.1 提取溶剂的选择

实验分别选取纯乙腈、80%乙腈溶液以及50%乙腈对样品进行提取，发现80%乙腈与纯乙腈的提取效率相近，分别为84.39%，86.17%，50%乙腈的提取效率较低，为45.72%，且考虑到纯乙腈价格较贵，故选择80%乙腈作为提取溶剂。为了进一步提升提取效率且考虑到提取溶剂酸碱性对提取效率的影响，实验向乙腈中加入1%甲酸与5%三乙胺进行样品提取，结果发现，80%乙腈、含有1%甲酸的乙腈溶液和含有5%三乙胺的乙腈溶液的提取效果相近，考虑到甲酸、三乙胺具有刺激性气味，最终选择80%乙腈溶液作为提取液。

2.1.2 净化方式的选择

通过查阅夏宝林等[3]、何雄等[4]、王连珠等[6]和孙金影等[7]文献与现行国家标准[8]发现目前样品净化方式主要有SPE（固相萃取）和QuEChERS样品前处理包两种方式。因此，实验在净化部分主要对比了这两种样品净化方式的效果。结果发现，SPE小柱在吸附五氯酚酸钠后需要对其进行淋洗和洗脱，通过对SPE小柱淋洗液的检测发现部分目标化合物会随淋洗液流失，同时发现SPE小柱洗脱液的洗脱效率未达到完全洗脱，而且对于部分样品存在SPE小柱被堵塞无法过柱的情况。而QuEChERS净化管中装入的N-丙基乙二胺（Primary Secondary Amine，PSA）可有效去除脂肪等杂质；C18对脂质也有强吸附作用，二者可共同作用去除样品中的干扰成分；同时净化管中的无水硫酸钠可去除提取过程中带入的水相而保留有机相，利于氮吹浓缩。

2.2 流动相的选择

实验考察了以甲醇与0.1%甲酸水、甲醇与5 mmol·L-1乙酸铵为流动相时五氯酚酸钠的峰形与保留时间，发现甲醇与5 mmol·L-1乙酸铵作为流动相时可提高离子化效率，增强响应，峰形窄而尖锐，保留时间合适。

2.3 基质效应考察

基质匹配标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率之比称之为基质因子。当基质因子在0.8～1.2可认为基质效应影响较小。50%甲醇配制的标准曲线线性方程为y=288.005 196x+378.1578 54，基质匹配曲线线性方程为y=257.182 437x+384.528 326，两条曲线线性系数均大于0.995。基质因子在0.8～1.2，可忽略基质效应。

2.4 线性范围、检出限和定量限

在优化好的仪器条件下将基质匹配标准工作溶液（0 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和80.0 ng·mL-1）进行进样分析，以五氯酚酸钠响应值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制基质匹配标准工作曲线。结果发现，五氯酚酸钠在0～80.0 ng·mL-1具有良好线性关系。通过逐渐降低加标浓度，检出限（LOD）以3倍信噪比（S/N=3）计，定量限（LOQ）以10倍信噪比（S/N=10）计。检出浓度下限为0.3 μg·kg-1，定量浓度下限为0.5 μg·kg-1，优于国标[8]。

2.5 精密度和回收率

取阴性样品进行0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1和5.0 μg·kg-1这3个水平加标，进行回收率与精密度测定，结果见表1。由表1可知，五氯酚酸钠的回收率在90.2%～98.3%，精密度在1.3%～2.2%。

2.6 实际样品检测

对25份市售牛百叶进行检测，均未检出五氯酚酸钠。

3 结论

本文优化了提取液种类、净化方式以及色谱柱，建立了一种用于测定牛百叶中五氯酚酸钠的方法。该方法定量限为0.5 μg·kg-1，回收率达到90%以上，重复性较好，相对标准偏差小于5%。基质效应影响较小，经方法学验证该方法可以满足牛百叶中五氯酚酸钠的检验分析要求。

参考文献

[1]马飞攀，穆乃花，王恒路，等.液液萃取高效液相色譜法分析水源水中酚类和苦味酸[J].工业水处理，2018，38（10）：95–97.

[2]张渊，谢萍娟，刘芬，等.顶空固相微萃取–气相色谱法测定尿中五氯酚[J].环境与职业医学，2016，33（12）：1187-1190.

[3]夏宝林，严秋钫，杨娜，等.增强型除脂固相萃取技术结合超高效液相色谱–串联质谱法测定动物源性食品中五氯酚残留量[J].食品安全质量检测学报，2019，10（14）：4698-4705.

[4]何雄，周静峰，汤海青.固相萃取–气相色谱–串联质谱法测定淡水鱼鱼肉中的五氯酚[J].食品安全质量检测学报，2018，9（9）：2096-2100.

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[6]王连珠，方恩华，王彩娟，等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中痕量五氯酚及其钠盐[J].色谱，2018，36（6）：518-522.

[7]孙金影，安丽红，杨敏，等.QuEChERS-高效液相色谱串联质谱法快速筛查分析食品中五氯酚酸钠残留[J].食品安全质量检测学报，2020，11（14）：4757-4762.

[8]国家卫生和计划生育委员会，农业部，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 动物源性食品中五氯酚残留量的测定 液相色谱-质谱法：GB 23200.92—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.