矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对高血糖损伤血管内皮细胞保护作用

张 茜, 张 丹, 周 楠, 赖晓蕊, 徐境一, 李嘉宝, 王 鑫, 杨 蕾

北部战区总医院 营养科,辽宁 沈阳 110016

糖尿病为常见的慢性病之一,慢性高血糖可以导致各种器官、尤其是心血管系统的损害,可能并发如冠心病、心肌病、心律失常等心血管疾病,主要原因是血管内高血糖水平使血管内皮结构产生改变,生理功能丧失导致血管损伤[1]。在高糖的环境下,内皮细胞一氧化氮合酶活性下降,一氧化氮(nitric oxide,NO)的生物利用度降低,导致血管舒张功能受损[2-3]。自然界中广泛存在的多种天然活性植物化学物,对于防治高血压、高血糖、高血脂等慢性代谢性疾病具有重要意义。花青素为食品植物中分布较广泛的黄酮类化合物之一,具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性等生物活性[4-5]。有研究报道,膳食中的花青素刺激胰岛素分泌,减少细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,且对肥胖诱导的炎症和氧化应激具有积极作用,与2型糖尿病的风险降低有关[6-7]。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)为自然界中常见、广谱存在的一类花青素,广泛分布于黑色或紫红色的蔬菜水果中[8-9]。有研究报道,C3G可保护大鼠心脏免受缺血/再灌注诱导的细胞凋亡和坏死,减轻多柔比星诱导的小鼠心脏毒性[10]。本研究构建了高糖诱导内皮细胞损伤的体外细胞模型,旨在探讨C3G对高血糖损伤血管内皮细胞的保护作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 主要试剂:C3G购自Polyphenols公司,青霉素-链霉素购自Solarbio 公司,胎牛血清、DMEM培养基购自康宁公司,胰蛋白酶购自美国Gibco公司,细胞增殖/毒性检测试剂盒(cell counting kit,CCK-8)购自碧云天生物技术公司,凋亡染色试剂盒购自Roche公司,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。主要设备:CO2培养箱(Sanyo公司,日本),多功能酶标仪(BioTek公司,美国),分析天平(上海天美天平仪器),超净工作台(苏州博立斯净化设备公司),倒置显微镜(Olympus公司,日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 内皮细胞培养、传代和分组 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)购于上海中国科学院细胞库。将HUVECs解冻复苏后加入含10%胎牛血清的改良Eagle培养基,置于5% CO2培养箱内培养,当细胞生长至密度80%左右时进行传代。将细胞分为普通对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高渗对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+27.5 mmol/L甘露醇)、高糖组(33.3 mmol/L葡萄糖)、高糖+低浓度C3G组(10.0 μmol/L)、高糖+中浓度C3G组(20.0 μmol/L)、高糖+高浓度C3G组(40.0 μmol/L)。

1.2.2 细胞活性检测 取对数生长期细胞进行实验,调整细胞密度至1×104个/ml后接种于96孔板,随机分为普通对照组、高渗对照组、高糖组、高糖+低浓度C3G组、高糖+中浓度C3G组、高糖+高浓度C3G组,每组设8个复孔,按照不同分组分别添加培养基。分别培养24、48 h后,采用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗细胞3次,每孔中加入10 μl的CCK-8溶液,37℃孵箱中孵育1 h,酶标仪读取每孔细胞上清液在450 nm波长时的吸光度值。

1.2.3 细胞凋亡检测 细胞接种于24孔板,分别添加不同培养基,培养48 h后,弃去培养基,4%多聚甲醛固定30 min,0.3% Triton X-100通透5 min, 染色液避光孵育1 h,二氨基苯基吲哚(diamidino phenyl indole,DAPI)复染细胞核,封片后在荧光显微镜下观察并拍摄。

1.2.4 细胞乳酸脱氢酶与一氧化氮释放量检测 将HUVECs细胞按普通对照组、高渗对照组、高糖组、高糖+C3G中浓度组、高糖+C3G高浓度组分别种于6孔板中,每组4个复孔,添加不同培养基继续培养。48 h后收集各组细胞上清液,按照试剂盒说明书,采用比色法测定各组上清液中细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)与NO含量。

1.2.5 细胞中MDA、SOD与谷胱甘肽检测 HUVECs细胞按照分组种于6孔板中,培养48 h后收集各组细胞。裂解液提取各组细胞中总蛋白,按照说明书测定HUVEC细胞中MDA、SOD与谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性变化。

1.2.6 细胞中ROS含量检测 细胞分组后种于96孔板中,培养48 h后换用无血清培养基,并在每孔中各加入1 μl DCFH-DA荧光探针,37℃孵育30 min。PBS洗涤3遍后,采用荧光酶标仪检测各孔荧光强度,设置条件为激发波长488 nm、发射波长525 nm,ROS释放量以平均荧光强度表示。

1.2.7 酶联免疫吸附法检测HUVECs细胞炎性因子分泌 细胞接种于24孔板中后,培养48 h,收集细胞上清液,根据试剂盒说明书进行肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、内皮缩血管肽(endothelin,ET)-1、可溶性细胞间粘附分子-1(soluble intercellular cell adhesion molecule-1,sICAM-1)与可溶性血管间粘附因子-1(soluble vascular cell adhesion molecule-1,sVCAM-1)含量测定。实验结果以培养液中所含上述炎性因子的质量浓度表示。

2 结果

2.1 各组细胞活力比较 普通对照组与高渗对照组24、48 h的HUVECs细胞活力比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。普通对照组24、48 h的HUVECs细胞活力均高于高糖组,差异均有统计学意义(P<0.05)。培养24 h时,高糖+中浓度C3G组、高糖+高浓度C3G组细胞活力均高于高糖组,差异均有统计学意义(P<0.05)。培养48 h时,高糖+低浓度C3G组细胞活力高于高糖组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 CCK-8法检测C3G对高糖作用下HUVECs活力的影响

2.2 各组细胞凋亡率比较 普通对照组与高渗对照组细胞凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。高糖组细胞凋亡率高于普通对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。高糖+中浓度C3G组、高糖+高浓度C3G组细胞凋亡率均低于高糖组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 原位末端标记染色检测C3G对高糖作用下HUVECs凋亡的影响

2.3 C3G对高糖作用下HUVECs中LDH、MDA、SOD、GSH影响 高糖组HUVECs细胞中LDH、MDA高于普通对照组,SOD、GSH低于普通对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。高糖+中浓度C3G组、高糖+高浓度C3G组细胞中LDH、MDA均低于高糖组,SOD、GSH均高于高糖组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 C3G对高糖作用下HUVECs中LDH、MDA、SOD、GSH影响

2.4 C3G对高糖作用下HUVECs中ROS影响 普通对照组、高渗对照组、高糖组、高糖+中浓度C3G组、高糖+高浓度C3G组细胞内ROS含量分别为(102.52±3.16)、(109.43±5.78)、(368.61±21.99)、(252.97±17.50)、(248.35±18.62)U/ml。高糖组细胞中ROS含量高于普通对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。高糖+中浓度C3G组、高糖+高浓度C3G组细胞内ROS含量均低于高糖组,差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.5 C3G对高糖作用下HUVECs内炎性因子影响 高糖组中NO低于普通对照组,ET-1、TNF-α、IL-1β、sICAM-1、VCAM-1高于普通对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。高糖+中浓度C3G组、高糖+高浓度C3G组NO均高于高糖组,ET-1、TNF-α、IL-1β、sICAM-1、sVCAM-1的分泌量均低于高糖组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 C3G对高糖作用下HUVECs中炎性因子生成的影响

3 讨论

糖尿病已经成为21世纪全球增长最快的疾病之一,心血管并发症为糖尿病患者发病及死亡的主要原因[11-13]。药食同源理论根植于传统中医药理论,不仅安全性高,还适于长期食用[14]。花青素为一大类黄酮化合物,广泛存在于自然界多种蔬菜水果中。有研究报道,花青素提取物具有预防或治疗炎症疾病的潜力,可以有效改善糖尿病症状、明显降低血糖、改善肝功能、保护神经元、提高记忆力[15-18]。糖尿病心血管病变、视网膜病变等多种并发症均始于内皮细胞功能紊乱,以内皮细胞凋亡加速、内皮细胞因子分泌失衡为主要表现[19]。内皮细胞作为血管的机械屏障,通过调节血管张力、血流速度、氧化应激、炎症等,在维持血管内环境稳定方面发挥重要作用。有研究报道,C3G能够影响葡萄糖代谢和胰岛素分泌,在高糖诱导血管内皮细胞功能损伤中发挥重要作用[20]。

本研究结果显示,与普通对照组比较,高糖组细胞活力下降,细胞凋亡水平增加,细胞内LDH、MDA含量上升,SOD、GSH含量降低,而且,高糖组细胞中ROS含量显著高于普通对照组,NO释放量下降,ET-1、TNF-α等炎症因子分泌量明显增加。这说明,高糖通过抑制细胞活力,增加细胞凋亡水平,激活细胞内氧化应激和炎症反应,对HUVECs造成明显损伤。本研究结果还显示,与高糖组比较,高糖+中浓度C3G组与高糖+高浓度C3G组细胞活力增加,NO、SOD、GSH水平明显升高,ET-1、TNF-α、IL-1β、sICAM-1和VCAM-1分泌显著降低,且呈现一定的剂量依赖效应。这说明,C3G对高糖损伤的内皮细胞具有保护作用,其作用机制可能是C3G通过调节内皮依赖的血管舒张功能、调节内皮细胞炎症和氧化应激水平,进而抑制糖尿病患者微血管和大血管并发症的发生。

综上所述,C3G能够明显恢复高糖损伤导致的内皮细胞活力下降,并抑制其凋亡、炎症和氧化应激水平,C3G对高糖诱导的内皮细胞损伤具有良好的保护作用,可能是一种新的治疗炎性血管疾病的策略,为高血糖损伤的防治提供了新思路。