免疫亲和柱净化-高效液相色谱技术检测食品中呕吐毒素的方法优化

胡云 邹勇平 ?王帅 周元元 梁志春 周可欣

摘 要：目的：建立了基于优化的免疫亲和柱净化高效液相色谱技术的呕吐毒素检测方法。方法：优化的免疫亲和柱淋洗条件为将1.5 mL甲醇以0.5 mL·min-1的流速分3次洗脱；优化的流动相为乙腈∶水=10∶90。结果：当呕吐毒素的载柱量在12.4～2 504.0 ng时，柱回收率为82.6%～103.2%；在98.6～4 930.0 ng·mL-1时，呕吐毒素的校正曲线为y=0.063 35x-0.815 90，相关系数为0.999 921。以优化后的实验方法分析小麦粉、醋和黄酒中的呕吐毒素，检出限为1.2～4.2 μg·kg-1，定量限为4～14 μg·kg-1；3种食品中呕吐毒素的3水平平均加标回收率为84.3%～104.7%，实验室内变异系数为0.3%～5.5%；对特性值为1 303 μg·kg-1，特性值区间为1 043～1 563 μg·kg-1的小麦粉质控样品中呕吐毒素的含量进行检测，结果为1 320 μg·kg-1。结论：优化后的检测方法灵敏、准确，适用于食品中呕吐毒素的检测。

关键词：免疫亲和柱；高效液相色谱；呕吐毒素；优化

Optimization of Immunoaffinity Clean-Up and High-Performance Liquid Chromatography for Determination of Deoxynivalenol in Food Products

HU Yun， ZOU Yongping， WANG Shuai， ZHOU Yuanyuan， LIANG Zhichun， ZHOU Kexin

（Yangzhou Centre for Food and Drug Control， Yangzhou 225000， China）

Abstract： Objective： An accurate method to quantify deoxynivalenol in food is described based on an optimized immunoaffinity clean-up and high-performance liquid chromatography technique. Method： The optimized elution conditions was： the immunoaffinity columns were washed with 1.5 mL methanol at a speed of 0.5 mL·min-1 and was devided into three washout; The optimized mobile phase was： acetonitrile∶water =10∶90. Result： When deoxynivalenol was applied to a immunoaffinity column with the concentration from 12.4～2 504.0 ng， the column recovery is between 82.6%～103.2%. The linear equation of deoxynivalenol is y=0.063 35x-0.815 90 within 98.6～4 930.0 ng·mL-1 and the correlation coefficient is 0.999 921. Food such as wheat flour， vinegar， and yellow wine were treated with optimized test method. The detection limit was between 1.2～4.2 μg·kg-1 and the limit of quantification was between 4～14 μg·kg-1. Average recoveries of deoxynivalenol from the three food spiked at three levels ranged from 84.3%～104.7%， with laboratory coefficient of variation between 0.3%～5.5%. A quality control wheat flour with characteristic value of 1 303 μg·kg-1 and the characteristic value ranged from 1 043～1 563 μg·kg-1 was detected and a result of 1 320 μg·kg-1 was got. Conclusion： The optimized detection method is sensitive and accurate and suitable for the detection of deoxynivalenol in food.

Keywords： immunoaffinity chromatography; high-performance liquid chromatography; deoxynivalenol; optimization

嘔吐毒素是镰刀属真菌污染玉米、小麦等谷物后产生的具有一定毒性的真菌毒素[1]，高剂量暴露后会引起拒食、呕吐和免疫功能抑制等症状[2]。我国国家标准对食品中呕吐毒素的限量要求有着严格的规定[3]。食品中呕吐毒素的检测方法较多，有液相色谱串联质谱法、液相色谱法、薄层色谱法、酶联免疫吸附筛查法等，其中液相色谱法因具有操作简便、定量准确、效率高等优点，是检验检测机构最常用的毒素检测方法[4]。本实验对小麦粉、醋和黄酒中呕吐毒素的净化方法和液相色谱条件进行优化，建立了一种灵敏、准确的食品中呕吐毒素的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

小麦粉、醋、黄酒均购于超市；呕吐毒素免疫亲和柱：3 mL/支，美国Romer labs公司；934-AH玻璃纤维滤纸，英国Whatman公司。

1.1.2 试剂

甲醇、乙腈，色谱纯，默克；聚乙二醇，化学纯，国药；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾，分析纯，国药；超纯水，由Milli-Q超纯水机制备；呕吐毒素标准物质溶液（197.2 mg·L-1）；溶剂（甲醇），色谱级，安谱。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪（配置DAD检测器），美国Agilent公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司；S210-K酸度计，美国METTLER TOLEDO公司；XSR204电子分析天平，美国METTLER TOLEDO公司；AH40全自动均质器，睿科集团股份公司；Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪，睿科集团股份公司；Auto EVA 80全自动平行浓缩仪，睿科集团股份公司。

1.3 实验方法

1.3.1 前处理方法

（1）提取。①小麦粉。称取小麦粉25 g于均质瓶中，参照《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》（GB 5009.111—2016）的方法[4]，加入5 g聚乙二醇和100 mL水，于20 000 r·min-1高速均质150 s，立刻转移至离心管中，于6 000 r·min-1离心10 min，上清液经玻纤滤纸过滤后备用。②醋。称取醋25 g，滴加50%（v/v）氢氧化钠溶液调节pH值至7.0，参照《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》（GB 5009.111—2016）的方法[4]，加入5 g聚乙二醇，水定容至100 mL，混匀，全部转移至均质瓶中，于20 000 r·min-1高速均质150 s，立刻用玻纤滤纸过滤后备用。③黄酒。称取黄酒20 g，参照《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》（GB 5009.111—2016）的方法[4]，加入1 g聚乙二醇，水定容至25 mL，混匀，全部转移至均质瓶中，于20 000 r·min-1高速均质150 s，立刻用玻纤滤纸过滤后备用。

（2）净化。将冷藏的呕吐毒素免疫亲和柱取出放置至室温，吸取2.0 mL备用的滤液，以1.0 mL·min-1的速度通过免疫亲和柱，先用5 mL PBS（pH=7.0）淋洗，再用5 mL水淋洗，淋洗速度2.0 mL·min-1，直至淋洗液全部通過免疫亲和柱，吹干柱体至无残留淋洗液，将1.5 mL甲醇以0.5 mL·min-1的流速分3次低速洗脱，收集全部洗脱液。

（3）浓缩。将洗脱液置于45 ℃的水浴中，以0.5 L·min-1的氮气吹至近干，流动相定容至1.0 mL，滤膜过滤后上机分析。

1.3.2 液相色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），美国Agilent公司；流动相：乙腈∶水=10∶90；流速：0.8 mL·min-1，柱温：35 ℃，进样量：50 μL；检测波长：218 nm。

1.3.3 标准溶液配制

分别移取5 μL、10 μL、25 μL、50 μL、100 μL和250 μL呕吐毒素标准物质溶液于10 mL容量瓶中，流动相定容至刻度，配制得98.6 ng·mL-1、197.2 ng·mL-1、493.0 ng·mL-1、986.0 ng·mL-1、1 972.0 ng·mL-1和4 930.0 ng·mL-1的呕吐毒素标准溶液。

2 结果与分析

2.1 前处理条件和色谱条件的优化

2.1.1 优化免疫亲和柱的净化条件

研究呕吐毒素的甲醇洗脱曲线，用2.0 mL甲醇洗脱柱载量为1 084.6 ng的呕吐毒素，分4次每次以0.5 mL·min-1的流速向免疫亲和柱中注入0.5 mL甲醇，等待10 s，注入和等待期间不使甲醇流出，然后以0.5 mL·min-1的流速洗脱，待此部分甲醇全部流出后，进行下一次洗脱，直至使全部的2.0 mL甲醇洗脱液流出。此方法的呕吐毒素洗脱情况见图1。由图1可知，第1次、第2次和第3次的甲醇洗脱液中呕吐毒素的量分别为29.1 ng、839.0 ng和201.0 ng，第4次的甲醇洗脱液中没有检测到呕吐毒素，洗脱液中呕吐毒素的总量为1 069.1 ng，柱回收达到98.6%，可见，使用1.5 mL甲醇以0.5 mL·min-1的流速分3次洗脱，能得到理想的柱回收效果。

将12.4 ng、19.7 ng、25.0 ng、49.3 ng、98.6 ng、197.2 ng、256.4 ng、295.8 ng、493.0 ng、754.3 ng、1 005.7 ng、1 104.3 ng、1 202.9 ng、1 301.5 ng、1 672.3 ng、1893.1 ng、1 991.7 ng、2 090.3 ng、2 253.0 ng、2 353.0 ng、2 504.0 ng、2 997.4 ng、4 003.2 ng和5 008.9 ng的呕吐毒素分别加载到免疫亲和柱，考察柱回收率，结果见图2。当呕吐毒素的载柱量在12.4～2 504.0 ng时，柱回收率在82.6%～103.2%，柱效较高，当呕吐毒素的载柱量在2 997.4 ng时，柱回收率在78.3%，柱效开始降低，当呕吐毒素的载柱量在5 008.9 ng时，柱回收率已持续降低至52.9%。由于呕吐毒素在自然界中的污染率较高，含量也高，高浓度的呕吐毒素应在载柱前进行适当稀释。

2.1.2 优化色谱条件

以甲醇∶水=20∶80的流动相进行分析，免疫亲和柱净化后的呕吐毒素在色谱分离的过程中仍存在杂质峰的干扰，改用乙腈∶水=10∶90的流动相进行分析，色谱基线更平稳，呕吐毒素色谱峰的峰型得到了改善，与杂质峰能实现有效分离，与TAN等[5]的实验结果一致，因此，实验选择以乙腈∶水=10∶90的流动相分析呕吐毒素。

2.2 方法的线性范围与检出限、定量限

呕吐毒素在98.6～4 930.0 ng·mL-1的濃度范围内，校正曲线y=0.063 35x-0.815 90，相关系数为0.999 921。用实验方法检测小麦粉、醋和黄酒中的呕吐毒素，检出限分别为1.2 μg·kg-1、1.2 μg·kg-1和4.2 μg·kg-1，定量限分别为4 μg·kg-1、4 μg·kg-1和14 μg·kg-1，低于国家标准中50～100 μg·kg-1的检出限，100～200 μg·kg-1的定量限，说明实验采用的方法具有较高的检测灵敏度。

2.3 方法的加标回收率与精密度

以标准规定的定量限、标准曲线的中间点和标准规定的最高残留限量（标准没有规定的，则选择标准曲线中浓度较高的点）进行3水平的加标回收试验[3-4，6]，每个水平重复6次，计算平均加标回收率和实验室内变异系数，结果见表1。小麦粉、醋、黄酒中呕吐毒素的3水平加标平均回收率在84.3%～104.7%，实验室内变异系数在0.3%～5.5%，符合国家标准规定的检验方法确认的技术要求[6]。其中，小麦粉的呕吐毒素3水平加标平均回收率较低，变异系数较高，主要是因为小麦粉为固体粉末状，呕吐毒素在其中分布的均匀度不及醋和黄酒。3种食品中均检出了呕吐毒素，小麦粉中的呕吐毒素源自小麦在生长期受到的镰刀属真菌的污染，黄酒和醋中的呕吐毒素源自生产原料中含有受镰刀属真菌污染的麦麸[7]，由于国家标准并未对黄酒和醋中的呕吐毒素规定限量要求，因此，有必要对市场上的醋和黄酒进行呕吐毒素的风险监测和分析评估。

2.4 方法的准确度

对呕吐毒素特性值为1 303 μg·kg-1，特性值区间为1 043～1 563 μg·kg-1的小麦粉质控样品进行检测，结果为1 320 μg·kg-1，说明本试验采用的检测方法准确度高，适用于食品中呕吐毒素的检测。

3 结论

实验优化了食品中呕吐毒素的免疫亲和柱的净化方法和色谱分离方法，方法灵敏度高，检出限和定量限均低于国家标准方法，定量结果准确。实验使用了自动化程度高的均质器、固相萃取仪和平行浓缩仪，在提高工作效率的同时，检测结果的稳定性也得到了提升。综上，本方法适用于食品中呕吐毒素含量的检测。呕吐毒素主要存在于谷物和谷物产品中[8]，但是，以被呕吐毒素污染的谷物为原料的发酵产品（如啤酒）的安全性也受到了越来越多的关注[9]，因此，鉴于我国国家标准目前没有对这类食品中的呕吐毒素规定限量要求，今后对这类食品中呕吐毒素的污染水平有必要进行风险监测和安全性评估。

参考文献

[1]SWEENEY M J，DOBSON A.Mycotoxin production by Aspergillus， Fusarium and Penicillium species[J].International Journal of Food Microbiology，1998，43（3）：141-158.

[2]Food and Agriculture Organization， World Health Organization （FAO/WHO）.Safety evaluation of certain contaminants in food.[EB/OL].（2016-01-05）[2023-01-20].https：//www.researchgate.net/publication/292874713_Safety_Evaluation_of_Certain_Contaminants_in_Food.

[3]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量：GB 2761—2017[S].北京：中国标准出版社，2017.

[4]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定：GB 5009.111—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[5]TAN L，LI Q，SUN CH，et al.An Efficient HPLC–PDA coupled with Supel? Tox DON SPE approach for the analysis of deoxynivalenol contamination in cereal grains and feedstuffs in jiangxi province[J].Journal of Food Protection，2023，86：100022.

[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范 食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.

[7]OK H E，LEE S Y，CHUN H S.Occurrence and simultaneous determination of nivalenol and deoxynivalenol in rice and bran by HPLC-UV detection and immunoaffifinity cleanup[J].Food Control，2018，87：53-59.

[8]GOLGE O，KABAK B.Occurrence of deoxynivalenol and zearalenone in cereals and cereal products from Turkey[J].Food Control，2020，110：106982.

[9]OMURTAG G Z，BEYO?LU D.Occurrence of deoxynivalenol（vomitoxin） in beer in Turkey detected by HPLC[J].Food Control，2007，2：163-166.

基金项目：江苏省市场监督管理局技术能力提升项目资助“食品中真菌毒素检验检测能力提升”（NL2021065）。

作者简介：胡云（1979—），女，江苏扬州人，硕士，高级工程师。研究方向：食品安全。