刺山柑果实正丁醇提取物对树突状细胞成熟的影响及机制研究*

阿力木·艾麦尔，慕丽红，刘晓颖，韩 鹏，王新绘，李金耀†

(1.新疆大学 生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830017；2.新疆大学 生态与环境学院，新疆 乌鲁木齐 830017)

0 引言

树突状细胞（Dendritic Cell,DC）被认为是免疫治疗中最具潜力的细胞[1].DC是专职的抗原递呈细胞，在抗原特异性免疫反应中起决定性作用[2].当病原体入侵时，机体外周组织未成熟的DC能够吞噬病原体，通过模式识别受体（Pattern Recognition Receptor,PRR）来识别病原体相关模式分子（Pathogen Associated Molecular Patterns,PAMP）促进DC的成熟，高表达趋化因子受体CCR7（C-C Chemokine Receptor 7），相应趋化因子信号迁移至引流淋巴结，将抗原递呈给初始T细胞，诱导产生抗原特异性细胞免疫反应.成熟的DC抗原吞噬能力降低，高表达共刺激分子CD40、CD80、CD86和主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex,MHC），分泌高水平细胞因子，参与DC和T细胞相互作用，调控获得性免疫反应的强度和类型[3－4].DC吞噬抗原，加工并递呈给初始T细胞的过程中，MHCⅡ递呈的抗原被辅助性CD4+T细胞识别，这一过程对于初始T细胞的激活至关重要.成熟DC表面的共刺激分子CD40、CD86有效刺激初始T细胞，诱导产生特异性的获得性免疫反应[5].DC分泌的细胞因子IL-12诱导初始T细胞分化成Th1细胞并分泌IFN-γ，DC分泌的细胞因子IL-23和IL-1诱导Th17分化并分泌IL-17，进而参与炎症反应和抗感染[6].

DC按功能分为免疫应答性DC和耐受性DC.免疫应答性DC具有激活T细胞和B细胞的功能，而免疫耐受性DC通过建立和维持外周T细胞耐受性来维持免疫稳态.耐受性DC在诱导Treg的生成中起重要作用[7].DC在类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）的发展中起重要作用，提高DC的耐受性，抑制TNF-α、IL-6和IL-1等促炎细胞因子产生，诱导调节性T细胞可以治疗RA[8].

中草药用于治疗多种人类疾病有着悠久的历史.越来越多的证据表明中药及其活性成分可调节DC的成熟和功能[9].中医用刺山柑（Capparis spinosa L.）治疗痛风和风湿性关节炎.本课题组前期研究显示，刺山柑果实经无水乙醇提取后，石油醚和乙酸乙酯萃取得到的水相能够抑制LPS（Lipopolysaccharides）诱导的DC成熟以及炎性细胞因子的表达[10].刺山柑果实总生物碱通过MAPK和NF-κB信号通路抑制LPS诱导的DC成熟及促炎细胞因子的表达，增加抗炎细胞因子IL-10的表达[11].本文在前期研究的基础上，进一步分离刺山柑果实95%乙醇提取物获得正丁醇相（Capparis spinosa L.fruit n-Butanol Extract,CSBE），研究CSBE的免疫抑制效果及有效成分，并对其作用机理进行初步研究.

本文检测了CSBE在体外抑制DC成熟及促炎细胞因子分泌情况，液相色谱-质谱联用（LC-MS）鉴定CSBE抗炎活性成分，网络药理学预测CSBE的抗炎作用靶点及通路，western blot验证关键靶点表达水平，探讨CSBE抑制DC成熟的作用及机理，为CSBE作为免疫抑制剂用于治疗RA等自身免疫性疾病提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

6～8周龄BALB/c小鼠购于新疆医科大学实验动物中心；刺山柑果产地为中国新疆伊犁；胎牛血清购于江苏恩莫阿赛生物技术有限公司；Penicillin-streptomycin双抗购于北京全式金生物技术有限公司；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor tumor necrosis factor,GM-CSF）购于Peprotech公司；流式抗体PE-CD40、APC-CD86购于BD Biosciences公司；RPMI-1640培养基和磷酸盐缓冲溶液（PBS）购于Gibco公司；LPS购于Sigma公司；western blot抗体及ELISA试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；95%乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯及NaCl等均为国产分析纯.

1.2 CSBE的制备

伊犁刺山柑果实打粉，过40目筛，按照料液比1∶6与95%乙醇混匀后超声20 min，60 ℃水浴提取2 h，提取3次并合并提取液，60 ℃旋蒸浓缩后，加适量蒸馏水使其重悬，加入NaCl至过饱和，分别利用石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇逐级萃取后收集正丁醇相，旋蒸浓缩后冻干置-80 ℃保存.

1.3 CSBE对DC成熟的影响

根据文献[12]获得DC，第7天收集细胞和上清培养液[13].用不同浓度的CSBE单独或与LPS联用处理DC 12 h后，加入PE-CD40、APC-CD86抗体，采用流式细胞仪（FACSCalibur，BD Biosciences）检测表面分子表达情况，FlowJo 7.6软件分析数据.DC用不同浓度的CSBE单独或与LPS联用处理12 h后，加入50 μg·mL－1FITCDextran共孵育1 h，采用流式细胞仪检测抗原吞噬能力.上清培养液根据ELISA试剂盒说明书检测IL-6、TNF-α，绘制标准曲线，计算相应细胞因子浓度.

1.4 LC-MS鉴定抗炎活性成分

色谱条件：C18色谱柱，正模式0.1%甲酸作为流动相A，负模式5 mmol·L－1醋酸铵作为流动相A，甲醇在两种模式下是流动相B.洗脱条件：0～1.5 min，2% B；0～1.5 min，2% B；1.5～12 min，100% B；12～14 min，100%B；14～14.1 min，2% B；14.1～17 min，2% B；柱温：40 ℃；流速：0.2 mL·min－1.

质谱条件：扫描范围100～1 050 m·z－1.ESI源设置：喷淋电压为3.2 kV，气流量为40 arb，辅气流量为10 arb，毛细管温度为320 ℃.

使用CD 3.1软件和Python（V3.5.0）对化合物进行定性定量分析，通过HMDB和Lipidmaps数据库进行代谢物注释，获得活性成分名称及含量等信息.

1.5 网络药理学预测靶点及通路

对CSBE的LC-MS结果进行分析，在NCBI查找相关文献筛选出具有抗炎活性的化合物.在Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中根据活性成分名称查询相应的SMILE编号，导入Swiss Target Prediction数据库（http://www.Swisstarget prediction.ch）进行化合物靶点预测[14].在GeneCards数据库（https://www.genecar ds.org）中以“rheumatoid arthritis”为关键词进行检索，获得疾病靶点.将药物预测靶点与疾病靶点绘制韦恩图并取交集部分，得到关键靶点.将活性成分与关键靶点导入Cytoscape 3.7.2构建CSBE活性成分-靶点的互作图.关键靶点导入Metascape（http://metascape.org）进行GO及KEGG富集分析，探讨作用靶点涉及的信号通路及参与的生物学功能，并通过R语言进行可视化.

1.6 蛋白质印迹（western blot）验证靶点

DC细胞以8×106个/毫升加入到细胞培养皿中，2 mg·mL－1浓度的CSBE刺激细胞，未刺激组为对照.2 h后加Golgistop，继续培养6 h，按照蛋白抽提试剂盒说明书上的操作步骤提取蛋白.取含30 μg蛋白的提取液，进行12% SDS-PAGE电泳.转至NC膜，用5%脱脂奶粉在37 ℃封闭2 h，TBST缓冲液（20 mmol·L－1TrisHCl、150 mmol·L－1NaCl、0.05% Tween 20）洗涤3次，分别加入相应的一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜.TBST洗膜后与HRP标记的二抗（1∶1 000）37 ℃孵育2 h，加入超敏ECL化学发光试剂，在Image Quant LAS 4000mini上曝光.β-actin作为胞质蛋白的内参.

1.7 数据统计分析

使用GraphPad Prism 5分析数据，通过单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行处理组与对照组之间的比较，P ＜0.05为差异有统计学意义.

2 实验结果

2.1 CSBE抑制LPS诱导的DC成熟

DC表面共刺激分子CD40、CD86与DC成熟及功能相关，抑制其表达能降低DC成熟.CSBE单独处理发现DC表面分子CD40与未处理组相比，没有显著性差异.1、2、3 mg·mL－1CSBE处理DC均能显著抑制CD86的表达；与LPS联合使用时，CSBE显著抑制CD40和CD86的表达，且具有剂量依赖性（图1A）.细胞因子在免疫系统中起到复杂而重要的作用.成熟的DC分泌TNF-α等细胞因子的分泌能力增加[1].CSBE单独处理DC时，TNFα和IL-6分泌与未处理组相比无显著差异；CSBE与LPS联合处理DC时，CSBE显著抑制了TNF-α和IL-6的分泌水平，并呈剂量依赖性（图1B）.CSBE单独或与LPS联用，都能显著增强DC胞内FITC-Dextran含量，说明CSBE增强了DC抗原吞噬能力（图1C）.以上结果说明，CSBE能显著抑制LPS诱导的DC成熟，但对未成熟DC无过度抑制作用.

图1 CSBE对DC成熟的影响

2.2 LC-MS鉴定CSBE活性成分

为鉴定CSBE抑制DC成熟的活性成分，对CSBE进行LC-MS分析.LC-MS结果显示，正离子模式下鉴定化合物774种，总离子流图（Total Ion Chromatogram,TIC）见图2A.筛选出具有抗炎活性的化合物49种，其中黄酮类、生物碱类、萜类、香豆素类、酚类、苯丙素类、有机酸类和其它类活性成分分别为8、11、9、2、6、5、3、5种（图2B、表1）.各类化合物的相对含量百分比分别为黄酮类3%、生物碱类19%、萜类3%、香豆素类0%、酚类58%、苯丙素类1%、有机酸类6%、其它类10%.其中：酚类含量最高，香豆素类含量最低（图2C）.各化合物结构式见图2D.

表1 正丁醇相正离子模式下具有抗炎活性的化合物

图2 CSBE正离子模式下的LC-MS结果

LC-MS负离子模式下的TIC见图3A.共鉴定出化合物395种，筛选出具有抗炎活性的化合物42种，其中黄酮类、糖苷类、生物碱类、萜类、有机酸类、苯丙素类、香豆素类和其它类活性成分分别为9、3、6、9、1、6、2、6种（图3B、表2）.各类化合物的相对含量百分比分别为黄酮类91%、糖苷类0%、生物碱类1%、有机酸类3%、萜类1%、苯丙素类2%、香豆素类1%、其它类1%.其中：黄酮类含量最高，糖苷类含量最低（图3C）.各化合物结构式见图3D.

表2 正丁醇相负离子模式下具有抗炎活性的化合物

图3 CSBE负离子模式下的LC-MS结果

2.3 CSBE治疗RA靶点预测

上述9大类化合物基于网络药理学进行RA靶点预测.通过GeneCards检索到RA靶点4 374个，通过Swiss Target Prediction数据库预测CSBE中具有抗炎活性化合物的靶点，并将各大类化合物靶点分别与RA靶点取交集作为关键靶点.预测到黄酮类、苯丙素类、香豆素类、酚类化合物关键靶点242个，其中黄酮类、苯丙素类、香豆素类和酚类独有靶点分别为45、48、11、7个（图4A）.构建化合物类型和疾病靶点网络，包括246个节点、458条相互作用关系.展示了天然产物具有多成分、多靶点的作用（图4B）.将关键靶点构建PPI网络，其中degree值排名前20的靶点作为核心靶点，包括AKT1、GAPDH、TNF、ALB、VEGFA、EGFR、CTNNB1、HSP90AA1和MMP9等（图4C）.

图4 CSBE中黄酮类、苯丙素类、香豆素类、酚类化合物靶点预测

萜类、生物碱类、糖苷类、有机酸类、其它类化合物关键靶点350个，其中萜类、生物碱类、糖苷类、有机酸类和其它类独有靶点分别为44、91、1、4、21个（图5A）.构建化合物类型和疾病靶点网络，包括355个节点、641条相互作用关系（图5B）.核心靶点包括AKT1、TNF、IL-6、GAPDH、VEGFA、IL-1β、SRC、EGFR、MMP9和TLR4等20个（图5C）.CSBE与炎症相关较强的靶点有TNF、IL-6、IL-1β和MMP9等.

图5 CSBE中萜类、生物碱类、糖苷类、有机酸类、其它类化合物靶点预测

2.4 CSBE作用机制分析

采用western blot对上述预测的靶点进行验证.采用2 mg·mL－1CSBE与LPS联用处理DC，12 h后收集细胞，提取蛋白质，western blot检测MMP9和MMP13的表达.结果显示CSBE显著降低LPS诱导的DC胞内MMP9和MMP13的表达（图6A），这与网络药理学预测结果一致，证明CSBE可以通过抑制MMPs的表达抑制DC迁移，进而影响DC功能.

图6 CSBE作用机制

通过Metascape数据库对化合物关键靶点进行GO生物学过程（GOBP）和KEGG通路富集分析，有机酸类化合物与RA，尤其是与Th17分化更相关，其中涉及的生物学过程包括辅助性T细胞的分化（T-helper cell differentiation）、Th17辅助性细胞的分化（T-helper 17 cell differentiation）和Th17型免疫反应（T-helper 17 type immune response）等（图6B）.涉及的KEGG通路包括磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路（PI3K-AKT signaling pathway）、Th17细胞分化（Th17 cell differentiation）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）和IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）等（图6C）.以上分析结果提示：有机酸类化合物是CSBE中治疗RA的主要活性物质，通过多靶点抑制DC成熟、促炎细胞因子分泌，通过抑制MMPs表达抑制DC迁移，进而抑制Th17细胞分化和IL-17产生，具有潜在的免疫抑制及治疗RA的作用.

3 讨论

DC作为先天免疫和获得性免疫反应的桥梁被广泛关注.根据疾病的发病机理，通过抑制DC的成熟程度来治疗炎症目前是医药界的热点之一，其中抑制DC来治疗RA取得显著的治疗效果[15].中药用于治疗疾病历史悠久，具有免疫调节及副作用低的优点.本文中CSBE显著抑制LPS诱导的DC表面分子的表达以及炎性细胞因子TNF-α和IL-6的分泌，通过抑制Th17分化及IL-17分泌治疗RA，有机酸类化合物是主要活性物质，为开发利用中药刺山柑治疗RA等疾病提供理论依据.

本文结合网络药理学和LC-MS鉴定的化合物对潜在靶点进行富集分析，结合信号通路描述了成分与作用靶点的关系.网络药理学预测发现，CSBE作用于RA共有的关键靶点degree值较高的包括AKT1、TNF、SRC、EGFR、MAPK3、STAT3、HSP90AA1和CASP3等，其中AKT1是AKT家族成员，活化的AKT上调CyclinD1、参与细胞周期、促进细胞增殖、抑制凋亡.有研究表明抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路能有效减缓骨关节炎的进展[16].舒芬太尼可通过上调miR-365-3p表达而抑制AKT1表达，进而抑制胃癌细胞迁移及侵袭[17].黄芪三仙汤通过抑制PI3K/AKT信号通路活化起抗骨质疏松的作用[18].高根胺通过激活AKT1和抑制EGFR/JAK2/c-JUN信号减轻过敏性鼻炎[19]，可见AKT1可调节细胞迁移，参与多种自身免疫疾病，是治疗自身免疫疾病的靶点之一.CSBE可能通过AKT1发挥免疫抑制及抗炎活性.

炎症是抵抗感染和损伤的保护性反应，TNF-α在慢性炎症发生中起重要作用，通过NF-κB和MAPK信号通路参与肿瘤和炎症发生.近年来，越来越多的证据表明炎症与多种慢性或恶性疾病密切相关，如2型糖尿病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和癌症等[20].TNF-α诱导STAT3、SRC和EGFR的活化，在肿瘤中TNFα-SRC-EGFR-STAT3信号转导通路促进炎症诱导肿瘤发生，在慢性炎症引起的疾病中，TNF-α表达升高，与TNFα受体结合并激活EGFR，活化下游STAT3，因此，推断EGFR是慢性炎症诱导肿瘤的桥梁[21].CSBE显著抑制了LPS诱导的DC分泌的TNF-α，提示CSBE可能通过TNF信号通路抑制炎症反应.HSP90AA1编码的热休克蛋白90α是热休克蛋白家族的成员，研究发现HSP90AA1是骨关节病中与自噬缺陷相关的生物标志物[22]，进一步证明HSP90AA1参与自身免疫疾病，是治疗自身免疫疾病的靶点之一，提示CSBE可能通过HSP90AA1发挥免疫抑制活性.Caspase3是一种与凋亡相关的蛋白酶，Caspase3活化时激活凋亡信号通路，分泌大量细胞因子，造成严重炎症反应.儿咳灵糖浆可以明显改善支气管哮喘小鼠肺组织中Caspase-3和TNF-α表达水平，该糖浆可能通过抗凋亡和改善炎症损伤发挥作用[23]，提示CSBE可能通过抗凋亡作用进而改善炎症损伤.

趋化因子广泛存在于炎症反应组织中，诱导炎症细胞向炎症组织迁移并参与免疫应答.有研究报道骨关节炎的软骨、滑膜和关节液等组织中发现了大量趋化因子表达[24].本文网络药理学预测结果中与趋化因子相关的蛋白包括AKT、SRC和STAT等，表明CSBE通过调节趋化因子信号通路调节免疫反应.HIF-1（低氧诱导因子）在低氧下能激活多种靶基因的表达，在关节炎、动脉硬化和自身免疫疾病患者的炎症部位发现了HIF的激活，HIF可以激活NF-κB，缺乏HIF-1的巨噬细胞迁移能力降低，炎性细胞因子的分泌降低[25].本文发现CSBE与LPS共同处理的DC的MMPs表达量下降，炎性细胞因子分泌水平降低，说明CSBE可能作用于HIF信号通路，降低细胞迁移以及炎性细胞因子的表达.

RA患者中Th17细胞数量增加，Th17/Treg平衡破坏在RA发病中起主要作用.IL-17是Th17细胞产生的特征性细胞因子，RA患者滑膜和滑液中Th17及其细胞因子IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α等细胞因子明显升高.IL-17缺乏或IL-17中和抗体能够缓解关节炎.IL-17促进IL-6、TNF-α、IL-1β和趋化因子加重RA的关节炎症.IL-17也可诱导软骨MMPs促进骨破坏[26]，提示CSBE通过抑制Th17细胞来减少IL-17，从而在治疗RA的过程中发挥作用.

MMPs参与细胞迁移、分化与凋亡、炎症反应和组织重构等多种生物学过程.MMP13在骨关节炎中调控TNF-α和IL-1β引起骨关节炎病程的进展.破骨细胞分泌和表达最多的是MMP9，MMP9敲除小鼠出现软骨细胞分化受损[27].缺血性脑白质病变中，MMP3、MMP9升高与疾病严重程度成正相关[28]，因此，MMP表达量升高会引起疾病.CSBE显著降低了LPS诱导的DC胞内MMP9及MMP13蛋白的表达，提示CSBE可能通过抑制MMP活性发挥抗炎功能.激活的STAT3被证明与细胞因子、生长因子、MMPs和血管生成因子的表达增加有关[29]，提示CSBE可能通过抑制STAT3来抑制MMP9和MMP13的表达，从而通过阻断DC迁移抑制炎症.

综上所述，CSBE治疗RA的活性成分主要是有机酸类化合物，主要作用于AKT1、TNF、SRC、EGFR、MAPK3、STAT3、HSP90AA1和CASP3等蛋白，调控Th17细胞分化和IL-17信号通路等信号通路，通过多靶点抑制DC成熟和促炎细胞因子分泌以及迁移，具有潜在的免疫抑制及治疗RA的作用，但其作用靶点及信号通路仍需要进一步探讨.