江苏省葡萄炭疽病菌群体对4种杀菌剂的敏感性

闫莉春 钱亚明 王西成 王壮伟 王博 吴伟民

摘要 为明确江苏省葡萄炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides群体对苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈和戊唑醇4种杀菌剂的敏感性和抗性水平，本研究采用菌丝生长速率法测定了来自江苏省7个地区的68株葡萄炭疽病菌对上述4种药剂的敏感性，建立敏感基线，并分析菌株抗性水平和抗性频率。结果表明：苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈和戊唑醇对供试68株葡萄炭疽病菌的EC50范围分别为0.03～1.20、0.05～3.48、0.14～1.20 mg/L和0.50～12.30 mg/L；对苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和咯菌腈的敏感基线分别为（0.53±0.032）（1.00±0.15） mg/L和（0.38±0.024） mg/L。68株菌株对戊唑醇的EC50平均值为3.61 mg/L，因敏感性频率分布不符合建立敏感性基线要求，故未建立敏感性基线。供试菌株对苯醚甲环唑均表现为敏感，对吡唑醚菌酯和咯菌腈呈现一定的低抗水平，抗性频率分别为4.41% 和3.03%；对戊唑醇呈低抗和中抗水平，抗性频率分别为16.18%和5.88%。该研究为防控江苏省葡萄炭疽病提供了理论指导。

关键词 葡萄炭疽病菌; 杀菌剂; 抗药性

中图分类号： S 436.631.15

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021692

Abstract To evaluate the sensitivity and resistance level of Colletotrichum gloeosporioides from Jiangsu province to difenoconazole， pyraclostrobin， fludioxonil and tebuconazole， a total of 100 samples of the infected fruits of grape were collected form seven different regions in Jiangsu province， after isolation and purification， 68 strains were obtained. The sensitivity of the 68 isolates to the four fungicides was determined using mycelial growth rate method. The results showed that the EC50 values of difenoconazole， pyraclostrobin， fludioxonil and tebuconazole to the 68 strains ranged from 0.03 to 1.20 mg/L， 0.05 to 3.48 mg/L， 0.14 to 1.20 mg/L and 0.50 to 12.3 mg/L， respectively. The sensitivity baseline of C.gloeosporioides to difenoconazole， pyraclostrobin and fludioxonil was （0.53±0.032） mg/L， （1.00±0.15） mg/L and （0.38±0.024） mg/L， respectively. The average EC50 value of tebuconazole was 3.61 mg/L， but the sensitivity baseline of C. gloeosporioides to tebuconazole was not established， because of frequency distribution of EC50 values of 68 strains did not meet the requirements for establishing the sensitivity baseline. The tested strains were all sensitive to difenoconazole， low-resistant to pyraclostrobin and fludioxonil with resistant rates of 4.41% and 3.03%， respectively， and low-resistant and medium-resistant to tebuconazole with resistant rates of 16.18% and 5.88%， respectively. This study would provide a reference for reasonable use of fungicides and theoretical basis for scientific prevention and control of grape ripe rot in Jiangsu.

Key words Colletotrichum gloeosporioides; fungicide; resistance

葡萄Vitis vinifera L.是江蘇省主要种植水果之一，种植面积达到4万hm2，为江苏省农业经济发展和农民增收贡献了重要力量［1］。随着种植面积的不断扩大，葡萄炭疽病在我国已广泛流行，尤其是在江苏等东部和南部温湿度较高的地区，有些年份发病非常严重，已成为限制葡萄产业发展的主要障碍［2］。葡萄炭疽病主要危害着色期或近成熟期的果实，受害初期果粒上产生褐色圆形小斑点，后逐渐扩大并在表面形成粉红色黏性物，严重时病斑扩展至半个或整个果粒，引起果实腐烂，严重影响果实品质和产量［3］。 在我国，引起葡萄炭疽病的病原是胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides复合种，目前尚无尖孢炭疽菌C.acutatum在我国引起葡萄炭疽病的相关报道［4-6］。

由于缺乏有效的抗病品种，化学防治仍然是目前防治葡萄炭疽病的主要方式，生产上常用的杀菌剂主要包括保护性杀菌剂和内吸性杀菌剂［7-8］。然而，长期频繁使用同类型杀菌剂，容易使病原菌产生抗药性，导致药剂防治效果降低甚至丧失。杨敬辉等发现江苏丘陵地区葡萄炭疽病菌种群对多菌灵的抗性菌株比率从2013年的2.34%上升到2017年的32.21%，表明该地区病原菌对多菌灵已形成抗药性流行［9］。陈聃等报道对甲基硫菌灵高抗和对戊唑醇低抗的葡萄炭疽菌株已出现［10］。徐杰等报道辽宁地区已出现对戊唑醇和代森锰锌表现为中低抗水平的葡萄炭疽病菌［11］。本课题组前期在江苏省各地调研葡萄炭疽病防控时发现，苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈和戊唑醇是农户在生产中使用频率较高的4种杀菌剂，为了明确这4种杀菌剂的防控效果，本研究测定了2020年从江苏省7个地区采集的68株葡萄炭疽病菌对这4种杀菌剂的敏感性，建立了江苏省葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和咯菌腈的敏感基线，并明确了江苏省葡萄炭疽病菌对4种杀菌剂的抗性水平，为江苏省葡萄炭疽病的合理用药及防控提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：2020年7月－9月，分别从江苏南京、盐城、镇江、泰州、徐州、江阴、连云港等7个地区共采集发病葡萄果实样品100份，经过分离纯化共获得葡萄炭疽病菌68株，转移至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面培养基上，于4℃冰箱中保存备用。供试菌株经多基因PCR联合鉴定均为胶孢炭疽菌复合种Colletotrichum gloeosporioides（未发表数据）。采样葡萄品种包括‘夏黑‘阳光玫瑰‘白罗莎和‘魏可。菌株详细信息见表1。

供试药剂：99%吡唑醚菌酯原药和98%苯醚甲环唑原药购于上海市农药研究所有限公司;96%戊唑醇和97%咯菌腈标准品购于北京振翔科技有限公司。所有药剂均溶于二甲基亚砜（DMSO）配制成10 mg/mL的母液，贮存于4℃冰箱备用。

PDA 培养基：称取200 g马铃薯洗净去皮并切成小块，加水煮烂，用两层纱布过滤，加入20 g葡萄糖，15 g 琼脂，补足1 000 mL无菌水，分装并高压蒸汽灭菌后备用。

1.2 试验方法

1.2.1 江苏省葡萄炭疽病菌对4种杀菌剂的敏感性测定

采用菌丝生长速率法测定供试菌株对4种杀菌剂的敏感性。将葡萄炭疽病菌于26℃恒温培养箱培养7 d，在菌落边缘打取菌龄一致直径5 mm的菌盘，转移至含系列浓度的不同药剂PDA平板中央，以添加DMSO的作为阴性对照。其中苯醚甲环唑的浓度梯度设为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L;吡唑醚菌酯的浓度梯度设为0.64、1.6、4.0、10、25 mg/L;咯菌腈的浓度梯度设为0.64、1.6、4.0、10、25 mg/L;戊唑醇的浓度梯度设为0.05、0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L。每个处理重复3次，置于26℃恒温培养箱中黑暗培养，待对照组菌丝铺满平板时用十字交叉法测量各处理的菌落直径，计算各浓度药剂对炭疽病菌菌丝生长的抑制率，并以药剂浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，计算供试药剂对每个菌株的毒力回归方程、相关系数和有效抑制中浓度EC50。本试验重复2次。

1.2.2 葡萄炭疽病菌对4种杀菌剂敏感基线的建立

分别将1.2.1获得的4种杀菌剂对68株菌株的EC50从低到高排列，设置相应的区间间隔，统计供试菌株EC50在各个区间的频率，绘制供试菌株对4种杀菌剂的敏感性频率分布图，并对数据进行Shapiro-Wilk正态性检验，若符合正态分布，则可将供试菌株的平均EC50作为江苏地区葡萄炭疽病菌对该药剂的敏感基线［12］。

1.2.3 葡萄炭疽病菌抗药性水平划分及抗性频率统计

抗性水平（抗性倍数）=菌株EC50/敏感性基线，抗性水平划分参照潘夏艳等［13］的划分标准并略作修改。抗性水平≤3为敏感菌株（sensitive， S）;3＜抗性水平≤5为低抗菌株（lowly resistant， LR）;5＜抗性水平≤10为中抗菌株（moderately resistant， MR）;抗性水平＞10为高抗菌株（highly resistant， HR）。抗性频率=抗药性菌株数/总菌株数×100%，统计菌群对各药剂的抗性频率。

基于1.2.2的研究结果，采用区分剂量法分析菌株对戊唑醇的抗性水平。在含5.0 mg/L戊唑醇的PDA平板上不能正常生长的菌株为敏感菌株，能在5.0 mg/L平板上正常生长而不能在10.0 mg/L平板上生长的菌株为低抗菌株，能在10.0 mg/L平板上正常生长而不能在20.0 mg/L平板上生长的为中抗菌株，能在高于20.0 mg/L平板上生长的菌株为高抗菌株［10］。

1.2.4 数据分析

采用Excel软件进行数据统计和菌丝生长抑制率的计算，采用DPS软件进行毒力回归方程、相关系数和有效抑制中浓度EC50的计算;采用SPSS 18軟件进行Shapiro-Wilk正态性检验。

2 结果与分析

2.1 葡萄炭疽病菌对4种杀菌剂的敏感性

苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈和戊唑醇对供试68株葡萄炭疽病菌的EC50分别介于0.03～1.20、0.05～3.48、0.14～1.20 mg/L和0.52～12.30 mg/L，最小和最大的EC50分别相差37.5、69.6、8.6倍和23.6倍，平均EC50分别为（0.53±0.13）（1.37±0.56）（0.45±0.26）mg/L和（3.61±1.84） mg/L（图1）。

2.2 葡萄炭疽病菌对4种杀菌剂敏感基线的建立

供试68株炭疽病菌对苯醚甲环唑的敏感性频率分布符合正态分布（W=0.925， P=0.062＞0.05）（图2a），因此将平均EC50 0.53 mg/L作为江苏省葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑的敏感基线。

供试68株炭疽菌株对吡唑醚菌酯的敏感性频率分布呈连续单峰曲线，表现为不对称的正态分布，表明葡萄炭疽病菌对吡唑醚菌酯的敏感性已产生了分化（图2b）。其中68株菌株中有54株位于主峰范围内，占总数的79.41%，表明大多数葡萄炭疽病菌对吡唑醚菌酯仍敏感，并且这些菌株的EC50值分布符合正态分布（W=0.965， P=0.074＞0.05），因此将该主峰内EC50平均值1.00 mg/L作为江苏省葡萄炭疽病菌对吡唑醚菌酯的敏感基线。

供试68株炭疽菌株对咯菌腈的敏感性频率分布呈连续单峰曲线，曲线右侧具有拖尾现象，表明部分菌株对咯菌腈具有一定的抗性。其中有89.71%的菌株位于主峰范围且符合正态分布 （W=0.973， P=0.082＞0.05），通过计算，求得正态分布峰内菌株的平均EC50是0.38 mg/L（图2c）。因此，将EC50平均值0.38 mg/L作为江苏省葡萄炭疽病菌对咯菌腈的敏感基线。

供试68株葡萄炭疽病菌对戊唑醇的敏感性频率分布呈现多峰曲线，且只有65%的菌株集中在主峰内，表明炭疽病菌对戊唑醇的敏感性存在显著差异，因此本研究未建立江苏省葡萄炭疽病菌对戊唑醇的敏感基线（图2d）。

2.3 葡萄炭疽病菌對4种杀菌剂的抗性水平分析

利用本研究确定的葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑的敏感性基线对供试68株葡萄炭疽菌进行抗性水平分析。经分析发现，江苏省68个菌株的EC50均小于敏感基线的3倍，未发现抗性菌株。按照地区分析，平均EC50最高（0.63 mg/L）的地区为江阴市，最低（0.42 mg/L）的为连云港市;最小EC50（0.03 mg/L）出现在盐城市，最大EC50（1.20 mg/L）出现在江阴市（表2）。总体看来，江苏省炭疽病菌对苯醚甲环唑处于敏感水平，葡萄生产中苯醚甲环唑可作为常用杀菌剂防治葡萄炭疽病。

基于本研究确定的葡萄炭疽病菌对吡唑醚菌酯的敏感基线，对68株供试菌株进行抗性水平鉴定。鉴定结果表明，供试菌株对吡唑醚菌酯处于敏感或低抗水平。供试68株菌株中，敏感菌株65株，低抗菌株3株，无中抗和高抗菌株。其中泰兴8株菌株中有2株低抗菌株，徐州4株菌株中有1株低抗菌株（表3）。

根据本研究建立的葡萄炭疽病菌对咯菌腈的敏感基线，对68株葡萄炭疽菌进行抗性水平鉴定。结果表明，江阴和南京各有1株菌株对咯菌腈表现为低抗，其他地区菌株均表现为敏感，无抗性菌株，对咯菌腈的总抗性频率为3.03%（表4）。

根据陈聃等［10］的炭疽病菌对戊唑醇的敏感基线，对68株炭疽菌株进行抗性水平分析。研究发现， 在68个供试菌株中，敏感菌株有53株，出现频率为77.94%;低抗菌株11株，出现频率为16.18%;中抗菌株4株，出现频率为5.88%，未发现高抗菌株（表5）。其中镇江、南京、连云港和徐州地区均出现1株低抗菌株;江阴25株菌株中出现低抗菌株3株，中抗菌株2株;盐城12株菌株中出现2株低抗菌株和1株中抗菌株; 泰兴5株菌株中出现2株低抗菌株和1株中抗菌株（表5）。从EC50值分布分析，江阴和盐城地区存在抗性较高的菌株，EC50值最高分别达到12.30 mg/L和11.05 mg/L。

3 结论与讨论

本研究通过菌丝生长速率法测定了江苏省葡萄炭疽菌株对苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咯菌腈和戊唑醇4种杀菌剂的敏感性和抗性，并建立了葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和咯菌腈的敏感基线。抗性水平研究结果表明，江苏省葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑表现为敏感，未发现抗性菌株，说明苯醚甲环唑可作为常规药剂用于江苏省葡萄炭疽病的防治。苯醚甲环唑属于麦角甾醇生物合成抑制剂（EBIS）中重要的一类杀菌剂，其作用原理是通过抑制细胞膜抑制细胞生长，造成细胞形态学和新陈代谢改变［14］。因其优异的防治效果，已被广泛用于植物炭疽病的防治［7，15］。但由于苯醚甲环唑属于单一位点杀菌剂，目前已有多种作物炭疽病菌对其产生了抗药性，例如芒果炭疽病菌、草莓炭疽病菌和杨树炭疽病菌对苯醚甲环唑出现抗药性［16-18］。本研究中葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑均表现敏感，可能与用药年限和剂量有关，因此在生产中应更加注重农药使用量和使用方法等，以延缓葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑抗药性的形成。

咯菌腈属于苯吡咯类杀菌剂，是一种新型的高效广谱内吸性杀菌剂。目前，咯菌腈的作用机制主要被认为与抑制PKⅢ激酶和葡萄糖磷酸化相关的转运过程有关，从而影响渗透压调节相关的信号转导途径，进而起到杀菌作用［19］。咯菌腈常用来防治作物灰霉病、炭疽病等多种真菌病害，具有良好的防治效果［20-22］。本研究中供试菌株对咯菌腈的抗性频率为3.03%，均表现为低抗，说明绝大部分菌株对咯菌腈仍表现敏感。目前关于葡萄炭疽病菌对咯菌腈抗药性的研究还鲜有报道，仅有报道番茄灰霉病菌和草莓灰霉病菌对咯菌腈产生了抗药性，说明在生产上单一、不合理的用药可能会加剧该类药剂产生抗药性［23-24］。

江苏省葡萄炭疽病菌已经对吡唑醚菌酯和戊唑醇产生抗性，抗性频率分别为4.41%和22.06%。吡唑醚菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类（QoIs），其作用机制主要是通过特异性结合线粒体呼吸链中细胞色素bc1复合物的Qo位点（泛醌氧化位点），阻碍电子传递，抑制线粒体的呼吸作用，进而抑制孢子囊萌发、游动孢子的释放和游动。吡唑醚菌酯是防治作物炭疽病的传统药剂，研究者为了提高其防治效果，开展了多项药剂混配等研究。研究结果表明，吡唑醚菌酯与苯醚甲环唑以质量比3∶2混配对核桃炭疽病防治具有较好的增效作用，吡唑醚菌酯与苯醚甲环唑以质量比1∶1对槟榔炭疽病防治增效最为明显［25-26］。因此，可开展吡唑醚菌酯与不同药剂的混配试验，提高对葡萄炭疽病的防效。戊唑醇与苯醚甲环唑同属于麦角甾醇生物合成抑制剂，该类药剂作用位点单一，可能是产生抗药性菌株的重要原因。由于戊唑醇在田间的广泛应用加之使用时间较长，已有葡萄炭疽病菌对戊唑醇产生抗性的相关报道［10］。有研究表明，将吡唑醚菌酯和戊唑醇按照1∶1的比例进行复配对葡萄炭疽病防治具有显著增效作用，在果穗套袋前使用能使病害防治效果达到90%以上［27］。本次研究发现，江苏不同地区葡萄炭疽病菌对戊唑醇的敏感性差异显著，可能与所在地区该类药剂的使用量与使用年限相关，为了更好地防控葡萄炭疽病，应尽量减少戊唑醇的使用量。

总之，江苏省葡萄炭疽病菌对吡唑醚菌酯、咯菌腈和戊唑醇表现出中低抗性，对苯醚甲环唑敏感性较强，该研究可为江苏省葡萄炭疽病的防控、合理用药提供理论指导和依据。

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（责任编辑：田 喆）