多花黄精炭疽病病原菌鉴定

但雨柔 刘铭 崔馨燕 马万里 汤子萱 尹福强

摘要 炭疽病是多花黄精最严重的病害之一。本研究从重庆市万州区采集疑似为炭疽病的多花黄精病叶，分离培养获得了培养性状不同的2株炭疽菌，致病性测定表明这2株菌株都可引起多花黄精炭疽病;利用核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）、肌动蛋白（ACT）、几丁质合成酶（CHS-1）和β-微管蛋白（TUB）基因进行多基因系统发育分析，发现这2株菌株分别与松针炭疽菌Colletotrichum fioriniae和博宁炭疽菌C.boninense聚在一起，形成明显分支。结合形态学特点，确定引起多花黄精炭疽病的病原菌为松针炭疽菌C.fioriniae和博宁炭疽菌C.boninense。其中松针炭疽菌C.fioriniae引起黄精炭疽病是首次报道。

关键词 多花黄精; 分离鉴定; 多基因系统发育分析; 松针炭疽菌; 博宁炭疽菌

中图分类号： S 432.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021699

Abstract Anthracnose is one of the most serious diseases on Polygonatum cyrtonema. Two strains were isolated from leave samples with symptoms of anthracnose of P.cyrtonema collected from Wanzhou， Chongqing. Following infection assay on the plant suggested that both strains were the pathogenic agents that were identified as Colletotrichum fioriniae and C.boninense based on morphological， cultural characteristics and phylogenetic analyses of internal transcribed space （ITS）， actin （ACT）， chitin synthase 1（CHS-1） and β-tubulin （TUB） gene. And this is the first description of C.fioriniae pathogen responsible for P.cyrtonema anthracnose.

Key words Polygonatum cyrtonema; isolation and identification; multiple-gene phylogenetic analysis; Colletotrichum fioriniae; Colletotrichum boninense

多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua是天门冬科Asparagaceae黄精属Polygonatum的多年生草本植物，是2015版《中国药典》收录的黄精属3个种中的1个，主要分布于重庆、四川、云南、贵州、湖南、浙江等地［1］。多花黄精药食同源，具有补气益肾、安五脏、润心肺之功效，是数十种复方滋补药剂的重要组成成分，市场前景广阔。多花黄精喜温暖湿润的环境，稍耐寒，怕干旱，海拔500～600 m最适宜其生长。

多花黄精是重庆市脱贫攻坚期间引进的主要中药材之一，目前在渝东北、渝东南多区县广泛种植，种植面积超过700 hm2。随着多花黄精栽培面积的不断扩大，各种病害的发生也日益加重，尤其是炭疽病，重病区随机选取100株，发病率达70%，严重影响了多花黄精的产量及品质。炭疽菌寄主范围广泛，变异丰富。引起多花黄精、滇黄精Polygonatum kingianum和鸡头黄精Polygonatum sibiricum炭疽病的病原菌主要有胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides［2］、果生炭疽菌C.fructicola［2］、博宁炭疽菌C.boninense［2］、尖孢炭疽菌C.acutatum［2］、滇黄精炭疽菌C.kingianum［3］和C.spaethianum［4］。本研究利用ITS、ACT、CHS-1和TUB构建多基因联合系统发育树，并结合形态学鉴定万州多花黄精炭疽病病原菌，旨在为该病的诊断和防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病叶采集

2021年5月于重庆市万州区龙驹镇花坪村多花黄精种植基地采集病叶，观察并记录其发病部位与病斑特点。

1.1.2 分子鉴定所用引物

扩增真菌DNA核糖体内转录间隔区（internal transcribed spaces，ITS）、肌动蛋白（actin，ACT）、几丁质合成酶（chitin synthase，CHS-1）和微管蛋白（β-tubulin，TUB）基因的引物（表1）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 病原菌的分离纯化

采用常规组织分离法从带有典型症状的病叶上分离病原菌［8］。对分离的病原菌进行单孢纯化［9］，并转移至PDA试管斜面培养基上，置4℃冰箱中保存备用。

1.3 病原菌的致病性测定

选取3株健康多花黄精植株，用灭菌的接种针在上部叶片主脉两侧对称地各穿刺1次，将直径5 mm的菌饼接种于叶片上，菌落正面紧贴叶片一侧穿刺处，同时另一侧穿刺处接种相同规格的无菌PDA作为对照，接种后用保鲜膜包裹接种处;接种后将盆栽多花黄精置于28℃保湿培养，观察记录发病情况，待接种叶片发病后从发病部位重新分离病原菌，并观察是否与接种菌株一致。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 形态学鉴定

将分离纯化的菌株接种至PDA平板上，置于培养箱中在28℃，L∥D=12 h∥12 h条件下恒温培养7 d，观察并记录菌落形态;待其产孢后，挑取少量孢子制作玻片显微观察，并随机选取50个分生孢子测量孢子大小。依据《真菌鉴定手册》中描述的病原菌形态对其进行形态学鉴定［10］。

1.4.2 多基因联合鉴定

使用植物基因组DNA提取试剂盒（DP305，购自天根生化（北京）科技有限公司）提取代表菌株A1，A2的DNA。采用表1引物对菌株进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为40 μL，包括2×ES PCR Master Mix 20 μL ［K1071，生工生物工程（上海）股份有限公司］，ddH2O 15 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，模板DNA 3.4 μL。反应程序如下，ITS：95℃预变性2 min;95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，33个循环;72℃延伸10 min。ACT：95℃预变性5 min;95℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，33个循环;72℃延伸5 min。CHS-1与TUB程序相同：94℃预变性5 min;94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸10 min。以ddH2O替代模板DNA作为阴性对照。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将获得的序列纯化后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。将测得的序列在NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）上使用BLAST进行序列比对和同源性分析，下载相似性高的序列及其相应的模式菌株序列（表2），使用TBTools软件和PhyloSuite软件对模式菌株以及A1、A2菌株的序列按照 ITS-ACT-CHS-TUB 的顺序进行编辑和串联，以甘薯黑痣病菌Monilochaetes infuscans（CBS 869.96）作为外群，使用 MEGA X软件按照 neighbor joining法构建系统发育树，bootstrap 设定为1 000。

2 结果与分析

2.1 多花黄精炭疽病症状、病原菌分离及致病性测定

多花黄精炭疽病主要危害中上部叶片，4月－5月开始发病，9月－10月尤为严重。发病初期，在叶片中间或边缘出现圆形或不规则小斑，随着病情发展，病斑逐渐扩大，病斑中央变为褐色甚至凹陷穿孔（图1a）。通过组织分离法得到108株菌株，根据培养性状分为两种类型，分别命名为A1、A2，其中A1类型64株，A2类型44株。单孢纯化后保存于重庆三峡学院生物与食品工程学院。

盆栽的健康多花黄精叶片刺伤接种A1菌株后5 d，围绕穿刺孔出现浅褐色病斑，与自然发病病斑相似，后期病斑干枯;A2菌株导致的症状与A1菌株相似，但相较于A1菌株，接种后发病速度较慢，病斑较小（图1）。对照无病症病斑。两个菌株再分离得到的菌株菌落、显微特征均与接种菌株相同。

2.2 分离菌株的鉴定

2.2.1 分离菌株的形态学特征

从病叶上分离得到两种不同形态的菌株，A1菌株菌落正面产生白色气生菌丝且蓬松（图2a），背面边缘橘黄色，中央橘红色（图2b）。菌丝平均生长速率为11.71 mm/d。显微镜下分生孢子单孢，透明，圆柱状，两端钝圆（图2c）。分生孢子大小为（11.72～12.87） μm × （3.90～4.30） μm，平均12.36 μm ×4.08 μm （n=50）。A2菌株菌落正面产生较少气生菌丝，菌落中间出现白色颗粒状（图2d），背面为白色菌丝，中间灰黑色且有一圈灰黑色颗粒（图2e）。菌丝平均生长速率为10.14 mm/d。显微镜下分生孢子单孢，透明，圆柱状， 基部平截呈脐状（图2f）。分生孢子大小为（10.18～13.97） μm × （4.10～5.10） μm，平均12.25 μm ×4.57 μm（n=50）。根据病原菌上述的形态特征，初步鉴定为炭疽菌属的两个不同种。

2.2.2 分离菌株的多基因系统发育分析

分离菌株的ITS、ACT、CHS和TUB基因序列的GenBank登录号分别为OK0661018（A1-ITS）、OL439942（A1-ACT）、OL439944（A1-CHS）、OL439946（A1-TUB）、OK662384（A2-ITS）、OL439943（A2-ACT）、OL439945（A2-CHS）和OL439947（A2-TUB）。在基于多基因构建的系统进化树中（图3），菌株A1与Colletotrichum fioriniae（菌株号LF603）聚为一个独立的进化支，支持率为98%;菌株A2与Colletrichum boninense（菌株号PL1p）聚为一个独立的进化支，支持率为100%。确定菌株A1为松针炭疽菌C.fioriniae，A2为博宁炭疽菌C.boninense。

3 结论与讨论

炭疽菌寄主范围广泛，复合种复杂。本研究通过分离鉴定，结合形态学及多基因系统发育树分析，将引起重庆市多花黄精炭疽病的病原菌鉴定为松针炭疽菌Colletotrichum fioriniae和博宁炭疽菌C.boninense，其中C.fioriniae引起黄精炭疽病是首次报道。

C.fioriniae是尖孢炭疽复合种Colletotrichum acutatum complex中的成员。1965年，澳大利亚的Simmonds在研究番木瓜腐烂病时分离到一种病原菌，将其命名尖孢炭疽菌C.acutatum［11］。2008年Marcelino等［12］首次发现C.fioriniae。C.fioriniae能够引起芍药Paeonia lactiflora［13］、黄缅桂Michelia champaca［14］等的炭疽病，但此前未见其引起黄精炭疽病的报道。

C.boninense最初属于C.gloeosporioides的广义种范畴［15-16］，Moriwaki等［17］利用基因系统分析发现C.boninense可进化为一个新的分支，从而将C.boninense鉴定为一个新的引起炭疽病的病原菌。C.boninense可引起多种中药材的炭疽病，包括滇黄精［3］、钩藤Uncaria rhynchophylla［18］、黄连Coptis chinensis［19］等，给中药材生产带来极大影响。

据报道，能够侵染滇黄精的炭疽菌较多，包括胶孢炭疽菌、果生炭疽菌、博宁炭疽菌和尖孢炭疽菌等［2］，但防治过程中一般并不区分其致病菌种属。除常规农业防治和物理防治外，也可选用咪鲜胺、多菌灵、氟硅唑、戊唑醇、己唑醇、咪鲜胺·三唑酮等化学药剂进行喷雾防治［18，20］。

参考文献

［1］ 朱志柳， 徐端妙， 张学鑫， 等. 不同海拔对林下多花黄精生长的影响［J］. 浙江农业科学， 2022， 63（3）： 36-39.

［2］ 马云云， 吴灿， 王兰芬， 等. 滇黄精炭疽病菌的初步鉴定及其对3种杀菌剂的敏感性［J］.农药学学报， 2020， 22（5）： 742-751.

［3］ 马维思， 郭兰萍， 王馨， 等. 滇黄精根状茎腐烂病致病新种的分离鉴定［J］.中国中药杂志， 2021， 46（21）： 5606-5613.

［4］ MA Ji， XIAO Xiong， WANG Xingyu， et al. Colletotrichum spaethianum causing anthracnose on Polygonatum cyrtonema in Anhui province， China ［J］. Plant Disease， 2021， 105（2）： 509.

［5］ WHITE T J， BRUNS T， LEE S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics ［J］. PCR Protocols： a Guide to Methods and Applications， 1990， 18（1）： 315-322.

［6］ 李沛利， 李娟， 龚国淑， 等. 四川省鹅掌柴炭疽病病原菌的初步鉴定［J］. 植物病理学报， 2017， 47（3）： 296-304.

［7］ 曹阳， 傅建伟， 褚建君. 水葫芦生防真菌Cercospora sp. FJ24的分离、鉴定及其分子生物学研究［J］. 上海交通大学学报（农业科学版）， 2011， 29（3）： 19-23.

［8］ 方中达. 植病研究方法［M］. 3版. 北京： 中国农业出版社， 1998： 1-427.

［9］ 龚国淑， 徐琴， 张敏. 一种简便的病原真菌单孢分离方法研究［J］. 玉米科学， 2020， 18（1）： 126-127.

［10］魏景超. 真菌鉴定手册［M］. 上海： 上海科学技术出版社， 1979： 1-780.

［11］SIMMONDS J. A study of the species of Colletotrichum causing ripe fruit rots in Queensland ［J］. Queensland Journal of Agricultural and Animal Sciences， 1966， 22（4）： 437-459.

［12］MARCELINO J， GIORDANO R， GOULI S， et al. Colletotrichum acutatum var. fioriniae （teleomorph： Glomerella acutata var. fioriniae var. Nov.） infection of a scale insect ［J］. Mycologia， 2008， 100（3）： 353-374.

［13］PARK M， LEE J， BACK C， et al. First report of Colletotrichum fioriniae causing anthracnose on Paeonia lactiflora in Korea ［J］. Plant Disease， 2020， 104（12）： 3259.

［14］ZHANG Lei， YANG Xiaoxiang， HUANG Xiaoqin， et al. First report of anthracnose on Michelia champaca caused By Colletotrichum fioriniae in China ［J］. Plant Disease， 2018， 102（10）： 2040.

［15］VON ARX J A. Die arten der gattung Colletotrichum Cda ［J］. Phytopathologische Zeitschrift， 1957， 29： 413-468.

［16］SUTTON B C. The Coelomycetes. Fungi imperfecti with pycnidia， acervuli and stromata： Colletotrichum ［M］. Kew UK： Commonwealth Mycological Institute， 1980： 523-537.

［17］MORIWAKI J， SATO T， TSUKIBOSHI T. Morphological and molecular characterization of Colletotrichum boninense sp. nov. from Japan ［J］. Mycoscience， 2003， 44（1）： 47-53.

［18］鄧洁， 莫飞旭， 石金巧， 等. 钩藤炭疽病病原鉴定、生物学特性及防治药剂筛选［J］. 中药材， 2020， 43（6）： 1303-1307.

［19］DING Haixia， CHENG Huanhuan， LI Jiye， et al. First report of Colletotrichum boninense causing anthracnose on goldthread （Coptis chinensis） in China ［J］. Plant Disease， 2020， 104（5）： 1538.

［20］贺竞锋， 刘先宝， 李博勋， 等. 橡胶树不同种炭疽菌对杀菌剂的敏感性及复配杀菌剂的药效评价［J/OL］.热带生物学报： 1-7［2022-04-25］.http：∥kns.cnki.net/kcms/detail/46.1078.S.20220316.1024.012.html.

（责任编辑：田 喆）