农产品中典型真菌毒素免疫检测技术及其应用研究进展

刘振江 潘兴鲁 郭艳国 吴小虎 徐军 董丰收 郑永权

摘要 真菌毒素是一类由产毒真菌产生的次级代谢产物。由于其种类多、毒性强、污染范围广的特点，对人和动物的健康存在威胁。因此建立精准、高效的真菌毒素检测技术对农产品中真菌毒素的监测和防控具有重要意义。免疫分析技术因其灵敏度高、检测速度快和对操作人员要求低等优点被广泛应用于农产品的检测。本文重点介绍了近年来黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及伏马菌素B1等典型真菌毒素快速免疫检测技术，分析了各检测技术的优缺点，并概述了其检测技术产品化，展望了今后真菌毒素检测技术的发展方向。

关键词 农产品; 真菌毒素; 免疫快速检测技术; 研究进展

中图分类号： R 155.5; TS 207.5

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2021681

Abstract Mycotoxins are secondary metabolites produced by toxic fungi. They are very harmful to human and animals due to their diversified variety， strong toxicity and wide pollution range. Therefore， the establishment of accurate and efficient detection technology for mycotoxins is of great significance for the monitoring of mycotoxins in agricultural products. Immunoassays are widely used for the detection of mycotoxins in agricultural products because of their high sensitivity， fast detection speed and low requirements for operators. This review focused on the rapid immunoassay methods of detecting typical mycotoxins such as aflatoxin B1， zearalenone， ochratoxin A， deoxynivalenol and fumonisin B1 developed in recent years， analyzed the advantages and disadvantages of each method， summarized the commercialization of immunoassay methods， and discussed the future development of mycotoxins detection technology.

Key words agricultural products; mycotoxin; immunoassay; research progress

真菌毒素是真菌在生長过程中产生的次级代谢产物，目前已经报道的1 000多种真菌的代谢产物中有近2 000种真菌毒素［1］。毒理学研究和食品安全监管机构最关注的有黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及伏马菌素B1等，这些真菌毒素广泛存在于粮食、油料和饲料等农产品中［2］。为此，制订科学的残留限量标准和建立有效的检测分析技术，对于保障人类生命健康具有重要意义。目前，真菌毒素的检测技术主要包括仪器分析法［3］和免疫分析法［4］。其中仪器分析方法对真菌毒素的检测往往需要昂贵的仪器设备，且操作复杂。而免疫分析有关的检测技术由于其具有特异性强、灵敏度高、易于操作等优点，受到了越来越多的关注与应用。本文重点讨论了黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及伏马菌素B1等真菌毒素的免疫分析技术，包括酶联免疫分析方法、时间分辨荧光免疫分析技术、免疫胶体金标记快速检测法、化学发光酶免疫分析技术、电化学免疫传感器检测技术以及免疫亲和柱层析净化-荧光光度法，并对其进行详细阐述。同时还介绍了免疫检测技术产品化研究进展，最后展望了今后真菌毒素检测技术的发展方向。

1 真菌毒素免疫检测技术研究进展

真菌毒素对农产品的污染已经成为日益严重的世界性问题，很多案例表明真菌毒素已经对人类的生存安全造成了严重的威胁［5］。因此，为了保障人类的生存健康，对真菌毒素进行准确监测和有效控制已成为政府以及产品检测企业的主要目标。目前真菌毒素的分析测定已有许多方法，其中免疫分析快检技术以其优越的特性引起了人们的广泛关注。

1.1 酶联免疫分析方法

酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）利用抗原与抗体的特异性结合以及高活性酶标记抗体催化底物的变化，实现高灵敏度快速检测的目的。ELISA具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，可通过光度、荧光等常规测量手段实现定量检测。目前已有大量文献报道了利用ELISA法检测真菌毒素，例如吕俊美［6］制备了玉米赤霉烯酮的单克隆抗体，研制了用于检测玉米、饲料和牛奶等食品中玉米赤霉烯酮试剂盒，检测范围为5.75～165.96 ng/mL。Liu等［7］创造性地制备了新型酶标二抗，利用金属有机框架同时包裹酶和抗体，大大提升了酶标二抗的热稳定性及有机溶剂耐受性，对比传统的酶标抗体其检测限提升了126倍，其对玉米赤霉烯酮检测范围为0.5 ng/L～0.476 μg/L。Pei等［8］发展了一种基于脲酶介导金纳米花金属化的新型等离子体共振ELSIA方法，用于超灵敏检测谷物和白葡萄酒中赭曲霉毒素A的含量，其检测限达到了8.205 pg/mL，检测范围为5.0～640 pg/mL。

目前，市面上已有多家公司生产ELISA试剂盒，用于玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及伏马菌素B1等真菌毒素的检测。由于其高灵敏度和特异性，非常适合批量样品的筛选。因此，ELISA法经常应用于大量样品的现场初筛。但其缺点是抗原抗体在特异性识别过程中容易受到环境因素以及交叉反应影响，酶稳定性和活性重复性差，易造成假阳性和假阴性的结果。

1.2 時间分辨荧光免疫分析技术

时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是利用具有特殊荧光信号的镧系离子与螯合剂结合标记蛋白质、激素和抗体等，在特定的反应体系中反应，然后使用时间分辨荧光仪测定特异性荧光强度，通过荧光强度推导分析物浓度的一种分析方法。相较于其他检测方法，TRFIA法具有可排除其他荧光干扰，灵敏度高，并且一次可以检测多个不同样品的优势。例如Wang等［9］结合时间分辨荧光传感和免疫层析的优点，利用铕纳米粒子标记黄曲霉毒素B1抗体，建立了一种灵敏、快速的黄曲霉毒素B1时间分辨荧光免疫层析检测方法。检测范围为0.3～10.0 μg/kg，检测限为0.1 μg/kg。Tang等［10］制备了铕和铽纳米球两种新型的荧光增强标记物，分别标记黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的抗独特型纳米抗体，建立了两条荧光时间分辨分析条带，用于黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的定量检测。在最佳条件下，检测黄曲霉毒素B1的线性范围为0.13～4.54 ng/mL，玉米赤霉烯酮的线性范围为0.20～2.77 ng/mL，其检测限分别为0.05 ng/mL和0.07 ng/mL。

目前，TRFIA具有很好的发展前景，若能够寻找并设计合成出一种比较理想的镧系螯合物探针，改进其标记和简化分离的技术，就可以提高其灵敏度。另外实现多重标记构建多分析物同时检测，将是今后研究的重点。

1.3 免疫胶体金标记快速检测法

免疫胶体金标记快速检测法（immunocolloidal gold labelling rapid assay）是利用胶体金作为标记材料，操作简便，其检测结果可实现可视化的一种分析方法，在免疫分析技术中得到了广泛应用。Hou等［11］利用25 nm的胶体金建立了多重免疫分析方法，可同时定性检测小麦和玉米样品中伏马菌素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮。条件优化后，其灵敏度得到极大提高。伏马菌素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的可视化检测限分别达到60、12.5 ng/mL和6 ng/mL。此外，胶体金免疫层析试纸条对这3种真菌毒素也具有很高的特异性，

伏马菌素B1与脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮

无交叉反应。卢宝驹［12］将黄曲霉毒素B1抗体与胶体金溶液混合，得到胶体金标记的黄曲霉毒素B1抗体溶液，以传统的控制线（C）及检测线（T）进行显色比较，制备了一个可快速检测黄曲霉毒素B1的试剂条。扶胜等［13］通过胶体金标记赭曲霉毒素A抗体，组装试纸条检测赭曲霉毒素A，结果表明，赭曲霉毒素A检测试纸条对谷物类样品检测限为5 ng/mL，对饲料样品检测限为100 ng/mL，检测时间为10 min，试纸条具有较好特异性，假阳性率小于5%，假阴性率为0。

虽然免疫胶体金标记检测法在检测真菌毒素中应用广泛，但其仍然存在一些不足之处。胶体金制备成本较高，易受环境干扰，同时也易受样品基质干扰。另外，免疫胶体金标记快速检测法结果采用肉眼观测，易对结果判断不一甚至出现错误。

1.4 化学发光酶免疫分析技术

化学发光酶免疫分析技术（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是将高特异性的免疫分析法与高灵敏度的化学发光分析法有机结合，以化学发光作为检测信号的一种新型免疫分析测定方法［14］。CLEIA在操作步骤上与ELISA基本相同，不同的是与酶反应的底物不是显色剂而是发光剂。CLEIA体系的发光强度有时会比较弱，通常会使用一些增强剂来增强光信号。这些增强剂能够影响化学发光反应的动力学，从而增强了光信号强度［15］。CLEIA法具有特异性强、灵敏度高、线性范围宽、操作方便并且自动化程度高等优势。已广泛应用于临床检验、环境检测、生物分析及真菌毒素快速检测等领域［16］。例如Liu等［17］基于噬菌体模拟表位取代化学合成的抗原，发展了一种新型CLEIA方法用于检测玉米赤霉烯酮。构建的CLEIA方法IC50为31.4 pg/mL，而常规ELISA方法的IC50为2.26 ng/mL。Wang等［18］利用生物素-链霉亲和素与金纳米颗粒有机组合进行信号放大，建立了一种高灵敏度的CLEIA方法检测食品中的玉米赤霉烯酮。Fang等［19］采用对碘苯酚增强的辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系作为信号检测系统，建立了一种检测黄曲霉毒素B1的CLEIA方法。该方法与市售ELISA试剂盒具有良好的相关性，相关系数为0.909 8，表明所建立的CLEIA方法可用于实际样品中黄曲霉毒素B1的测定。

1.5 电化学免疫传感器检测技术

电化学免疫传感技术（electrochemical immunosensor）是以抗原抗体间特异性反应为基础，结合电化学传感器简单和高灵敏的特性构建的一种高灵敏度的快速分析技术。其检测原理是以固定在支持物表面的抗原或抗体作为识别元件，识别对应的抗体或抗原并且形成稳定的复合物，再将免疫反应的有关变化转换为电信号，通过信号处理器处理实现对目标物的检测。电化学传感器拥有很多优良特性： 1）节省了检测时间，并使检测成本大大降低;2）操作简单便于携带，易于推广使用;3）应用范围广、前景好，可被推广到多个领域，如食品检测、医疗安全、环境保护及发酵工业等［20］。

目前，研究者已开发出多种电化学免疫传感器用于检测真菌毒素。例如Zhang等［21］采用双抗体夹心法检测黄曲霉毒素B1，检测范围为0.01～100 ng/mL，检测限为0.003 5 ng/mL，此传感器已经被应用于玉米粉中的黄曲霉毒素B1检测，效果良好。Foubert等［22］为了检测玉米赤霉烯酮，使用不同策略将玉米赤霉烯酮抗体固定在金电极表面，并对其性能进行比较。開发了一种高灵敏度的流动注射电容式免疫传感器，分析时间更短。Abdul Kadir等［23］ 报道了一种用单克隆抗体修饰的丝网印刷金电极和银-氯化银假参比电极测定伏马菌素的电化学亲和传感器，其检测限为5 μg/L，检测范围为1～1 000 μg/L。

1.6 免疫亲和柱层析净化-荧光光度法

免疫亲和柱层析净化-荧光光度法（immunoaaffinity column-fluorescence detector， IAC-FD）是利用免疫亲和柱将待测样品净化，结合荧光光度测定， 快速、准确、定量分析真菌毒素的一种方法。Lee等［24］利用IAC-FD法对生牛乳中的黄曲霉毒素M1进行了检测，其检测限可达0.002 μg/L，添加回收结果也满足残留检测的要求。王晶等［25］利用IAC-FD法测定酱油和醋中黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）含量，检测限分别可达到2.5 μg/kg和1 μg/kg，其中酱油中添加平均回收率为89.3%～103.5%，相对标准差为4.6%～11.9%，醋中添加平均回收率为86.9%～97.3%，相对标准差为3.6%～6.3%。王勇等［26］利用IAC-FD对鸡饲料中的黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）进行了检测，该方法的检测限为2.0 μg/kg，相对标准偏差低于10%，平均回收率为85%～90%。

IAC-FD法以其灵敏度高、高效、有毒有害试剂使用少、样品量少、检测时间短（10～15 min）和自动化程度高等优点得到了迅速发展，目前市面上已有多种检测真菌毒素的免疫层析亲和柱产品，但产品较为昂贵，且需配备相关仪器设备才能实现自动化荧光定量检测。不适用于现场检测，可用于实验室检测批量样品。

2 真菌毒素免疫检测产品化研究进展

目前，真菌毒素的快检产品主要是以免疫分析方法的应用为主。主要包括两种：一是酶联免疫吸附法为主的快速检测试剂盒，其是最早应用在医学检测的商品化产品，后来逐渐应用于农产品中真菌毒素检测领域;二是胶体金免疫层析技术为主的快检试剂卡，其以操作简单、检测速度快、成本低廉、适用于现场检测的优点，在20世纪末期得到初步发展并逐渐成为快速检测产品的代表。

基于真菌毒素的严重危害，各个国家和地区都发展了相关快检产品来检测真菌毒素。例如奥地利Romer公司生产的侧向层析检测试纸（AgraStrip）可快速检测多种食品和饲料样品中的真菌毒素，分析用时最短只需3 min。AgraStrip Pro Total Fumonisin WATEX检测伏马菌素总定量范围0～44 mg/L，检测限0.1 mg/L;AgraStrip Pro Total Aflatoxin WATEX检测黄曲霉毒素总定量范围0～460 ng/mL，检测限为2 ng/mL;AgraStrip Pro Zearalenone WATEX检测玉米赤霉烯酮总定量范围为0～1 650 ng/mL，检测限25 ng/mL。ELISA酶联免疫检测试剂盒（AgraQuant）可同时检测多个样品，只需20～65 min即可完成42个样品的检测。美国Beacon公司生产的赭曲霉毒素检测试剂盒检测范围2.0～50 ng/mL，检测限为1.0 ng/mL;玉米赤霉烯酮检测试剂盒检测范围0.02～1.0 mg/L，检测限为10 ng/mL。苏州快捷康生物技术有限公司研发的黄曲霉毒素B1试剂盒灵敏度为0.025 ng/mL，检测时间75 min;玉米赤霉烯酮试剂盒灵敏度为0.5 ng/mL。

许多学者对现有的真菌毒素快检产品进行了评价。例如周刚刚等［27］对德国R-biophar M生产的黄曲霉毒素M1检测试纸条进行了检测评价，结果发现该产品可定性检测牛奶中的黄曲霉毒素M1污染，检测能力满足欧盟MRL要求。罗昱芬等［28］采用仪器法和青岛Pribolab有限公司的 ELISA试剂盒同时测定牛乳中黄曲霉毒素B1和M1，结果发现仪器法测定高浓度M1时准确性优于ELISA法。原因是ELISA法抗体在其特异性、敏感性以及稳定性上都有一定缺陷。吕秋威等［29］评价了国内外应用较广的9个品牌的不同真菌毒素检测试剂盒，各品牌试剂盒对相应需要检测的真菌毒素的检测效果均较好，准确性和精确度都相对较高，但是尚未有一个品牌的试剂盒可以很好地同时检测黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇这3种毒素。

3 展望

本文重点介绍了几种常见的真菌毒素免疫检测技术，并对这几种真菌毒素的免疫快速检测技术进行了概述，对其优劣之处进行了分析，同时介绍了其技术的产品化情况。虽然检测真菌毒素的免疫检测技术有很多，但仍然存在一些不足之处：1）目前只有酶联免疫吸附法为主的快速检测试剂盒与胶体金免疫层析技术为主的快检试剂卡得到产业化，其他免疫分析技术的产业化还有较长的路要走;2）现有的真菌毒素免疫快检产品主要是针对单一毒素分析，而农产品中常常存在两个或两个以上的毒素，今后应加强同时检测多种毒素的免疫分析技术，以提高检测效率和节约成本;3）抗体是免疫分析的核心，应进一步研发高质量的真菌毒素抗体，提高免疫分析技术的稳定性和可靠性。

随着人们生活水平的逐渐提高，针对食品健康领域出现的各种问题，促使人们对食品安全的关注度空前提升。免疫快检技术非常适合农产品中真菌毒素的快速分析，继续深入研究和发展可靠的免疫分析技术和免疫分析产品，对及时掌握真菌毒素污染水平和有效控制具有重要意义。

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（责任编辑：杨明丽）