海藻生物制药推动海洋强国建设研究进展

任子安　陈俊任　王渤等

关键词：海藻;多糖;海洋生物制药;微藻

中图分类号：P745 文献标志码：A 文章编号：1005-9857（2023）04-0079-09

0 引言

国家生态文明建设和“十四五”规划对“提高海洋资源开发能力”“积极拓展海洋经济发展空间”做出新部署。我国海域辽阔，海洋生物资源丰富，发展海洋经济具有得天独厚的优势[1]。海藻作为丰富的海洋生物资源，种类超过15000种，主要分为蓝藻、绿藻、红藻、褐藻四大类，以其生长周期短、不占用农业耕地、可生物合成多种天然活性产物等竞争性优势進入能源研究的主流[2-3]。因此，研究和开发利用海藻资源成为发展海洋经济的新突破点。

海藻细胞内含有丰富的多糖（占干重的30%左右），具有较高的药理活性[2，4]，是抗肿瘤、预防心血管疾病、提高机体免疫力的天然化合物[5-6]。因此，实现海藻细胞内多糖的高效积累是未来海洋生物医药研究领域的前沿热点。然而随之带来的是大量海洋生物制药废水源源不断排入海洋，对海洋生态环境产生一定影响，成为海洋生物制药业亟待解决的攻关难题[7-9]。关于这方面的综述很少报道，对面临的难题及技术瓶颈讨论较少。本研究从药用海藻资源的开发、药用海藻资源的培养、海藻生物制药的环境保障分析入手，分析海洋生物制药存在的瓶颈，挖掘切实可行的解决途径，提出“海洋微藻生物制药全链条”新理念，构建海洋生物制药废水利用—海洋微藻培养—海洋微藻多糖制药的生物地球化学循环全链条网络，促进壮大海洋生物医药战略性新兴产业，带动海洋传统产业绿色转型升级，对于助力海洋强国建设、提升海洋生物医药的经济效益和市场竞争力具有显著的科学意义和社会效益。

1 药用海藻资源的开发

海藻独特的化学成分及其快速生长为生物提炼提供许多机会。然而，在利用海藻进行化学生产方面仍然存在许多挑战，如海藻化学成分的季节性变化很大。凭借海藻巨大的潜力和独特的化学成分，海藻可以为可持续的环保化学和燃料工业做出巨大贡献[10]，实现海藻生物制药推动海洋强国建设。截至目前，海藻多糖积累主要聚焦于大型海藻[11]，如海带、龙须菜、海葡萄。

1.1 海带

海带属于褐藻，含有多种生物活性物质，如多糖、琼脂、卡拉胶。多糖是一类生物大分子，常以糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等形式存在和参与生命活动。海带产生的多糖有非常高的药用价值，其炎症调节、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等功能在医药行业中具有应用潜力[12]。海带体积较大，培养体系单一，培养海带一般采用水平海带绳栽培法种植在浮筏上[13]。近年来对于典型的多糖提取方法进行大量的研究，其中包括加热法、溶剂法、超声法、酶法和微波法。褐藻中的多糖（包括海带）常采用4种技术提取：热水提取（HWE）、超声波辅助提取（UAE）、酶辅助提取（EAE）和酸辅助提取（AAE）。Yin等[14]通过实验发现UAE提取的多糖具有更高的产率（9.73%）。与传统的加热和微波辅助提取方法相比，超声波辅助固液提取在较短时间内提取率较高且绿色环保，但仍然需要75min。Dai等[15]采用高效液相色谱法从海带中分离提取多糖，提取过程比较复杂且耗能较高;发现超声波辅助固液提取2种多糖的最佳工艺条件为：温度40℃、乙醇为溶剂、pH 值为6、提取时间40min、质量比1∶30，在此条件下褐藻糖和层聚糖的回收率分别为94.29% 和88.90%。

此外，Yu等[16]用100 mL 的锥形烧瓶培养被高速粉碎机研磨好的海带，实验得到的多糖产率为1.26%;采用基于统计的响应面法对海带多糖的提取工艺进行优化，沉淀物用无水乙醇洗涤6次;最佳条件为：pH 值3.4、温度83℃、提取时间3.95h、水与海带的比例为1∶23。此方法提取时间较长，能耗较高。

1.2 龙须菜

龙须菜是可食用的经济红藻，富含多糖、藻胆蛋白、色素、矿物质等营养成分和功能成分。龙须菜比较硬，从海洋中采集龙须菜后必须用机械粉碎成粉末才能充分提取，提取方式复杂、耗时长且培养体系单一。对龙须菜产糖的研究如今愈发成熟，Long等[17]从提取、纯化、结构特征和生理活性等层面简要概述龙须菜多糖（GLP）的特征。从龙须菜中提取多糖的方法有热水提取法、超声波提取法、柠檬酸提取法。柠檬酸提取法是近年来常用的提取方法，与热水和超声波提取方法相比，柠檬酸能有效提高多糖的产率[17]。Yang等[18]采用毛细管区带电泳安培检测法对龙须菜中性糖进行分析，采用壁喷式CZE-AD 法测定芦笋多糖的组成并制备多糖，发现多糖由岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖和木糖组成，摩尔比为0.2∶16.2∶5.0∶1.0∶15.5∶0.6∶18.8。

此外，超声循环法也是研究者常用的方法。Zhao等[19]通过超声循环提取技术提取龙须菜多糖，采用Sevag法先对粗多糖进行脱蛋白处理，处理3次，采用乙醇浓度梯度（40%、60%和80%）分级沉淀得到3 个主要多糖组分即AOP-4、AOP-6 和AOP-8。Zhao等[20]使用超声波循环提取技术从龙须菜中提取多糖，该过程需用脱水乙醇提取6次，操作起来较为复杂;最佳提取条件为：超声功率600W，提取时间46min，液固比35mL/g;得到的多糖实验产率为3.134%，多糖由葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖组成，比例为2.18∶1.86∶1.50∶0.98∶1.53。

1.3 海葡萄

海葡萄是可食用的绿藻，用消化容器培养，富含维生素、蛋白质和多糖物质[21]。宋伟康[22]采用的海葡萄取自文昌龙楼海藻养殖场，研究发现用超声波辅助NaOH 溶液对海葡萄进行多糖提取，在液料比为42∶1、提取温度为72℃、提取时间为6h的最优提取条件下，重复提取3次，得到海葡萄多糖（CLP）的最高提取率11.8%。

传统水提醇沉提取法的海葡萄多糖得率为30.21%。为研究海葡萄多糖提取工艺条件，王小兵等[23]从海南琼海龙湾港采集海葡萄，以蒽酮-浓硫酸法测定粗多糖中的总糖含量为指标，采用正交实验L9结合加速溶剂萃取技术（ASE）对海葡萄多糖提取工艺进行优化;结果显示海葡萄多糖的最佳提取工艺条件为：温度120℃、静态提取2次、每次35min，提取温度对多糖提取率具有极显著影响;在最优条件下，海葡萄多糖得率为51.03（±0.62）%。与传统水提醇沉提取法相比，该提取工艺具有操作简便、缩短提取时间、节能耗、多糖得率高等优点，是快速经济实用的新型工艺。

综上所述，海带、龙须菜、海葡萄等大型海藻由于体积庞大，只能利用池塘或锥形瓶等简单容器培养，培养体系单一、传统;由于大型海藻细胞壁厚而硬，提取多糖时需要进行脱蛋白、乙醇浓度梯度分级沉淀等前处理，提取次数多、提取时间长、操作复杂、能耗高，且难以对多糖积累进行精准调控。此外，大型海藻种类较少，以海洋微藻为着眼点进行多糖生产是亟待挖掘和开发的有潜力的海洋生物医药的种质资源。

1.4 海洋微藻

微藻是小型的单细胞生物，因其生长速度快、多糖含量高、不占用耕地、碳中和等优良的特性，被认为是很有前景的生物医药种质资源，并且微藻在环境保护、生物修复和能源生产方面有巨大的潜力。Yap等[24]采用光生物反应器培养微藻，其不仅用于生物修复过程，还可以通过结合清洁和绿色技术从微藻中获得收入，以实现长期可持续性和环境效益。不同种类的微藻具有不同的化学结构和生物活性。

硫酸化多糖（TSP）是主要由半乳糖组成的杂多糖，是从丝状微藻（Tribonemasp.）中提取的，能刺激巨噬细胞显示出显著的免疫调节活性和抗癌活性。Chen等[25]从T 核糖体（TSP）中提取硫酸多糖，TSP的抗癌活性主要是诱导细胞凋亡，不是影响细胞周期和有丝分裂。Sun等[26]使用鞭藻用f/2培养基在锥形烧瓶中培养，采用阴离子交换柱层析和重复凝胶层析相结合的方法，成功从鞭藻中分离3种多糖即IPSI-A、IPSI-B和IFSII，这3种多糖被证明对超氧物和羟基自由基具有中度清除活性，并且其中度还原能力与浓度有关。Huo等[27]將微藻培养在灭菌BG11 培养基中，在恒温摇床（温度25℃，转速150rpm）中生长;富糖丝状微藻在2%CO₂下的总多糖含量高达50%;热水萃取-乙醇沉积提取多糖的最佳条件为：温度80℃、提取时间30min、pH 值9、液料比0.5∶1，多糖的最大产率为27.25%。

海洋微藻多糖是海洋微藻的生物活性物质之一，其中微藻的提取比大型海藻简单。海洋微藻多糖提取率随温度的升高而显著提高，而且提取时间能够影响海洋微藻多糖的提取[27]。红藻多糖SCSIO-45730 是多糖和β-葡聚糖的极好来源。Wang 等[28] 从南海西沙群岛提取微藻，培养在1500mL垂直鼓泡柱光生物反应器中，当归多糖（ASP）的提取率为5.6%，萃取时间10min，萃取温度100℃，萃取次数2 次;基于Box-Behnken设计（BBD）的响应面法（RSM），对SCSIO-45730 多糖（RSP）的热水提取进行优化，在最佳提取条件下RSP的产率最高为9.29%，萃取温度为84℃，提取时间25min;理化表征结果表明，RSP具有较高的硫酸盐和糖醛酸含量，分别为19.58%和11.57%，层次结构粗糙，主要含有葡萄糖、半乳糖、木糖和半乳糖醛酸，质量分数分别为34.08%、28.70%、12.46%和12.10%。

与大型海藻相比，已发现的海洋微藻有上万种，种类繁多;可以采用光生物反应器培养，培养工艺先进，多糖生产成本低。然而目前以海洋微藻为着眼点进行多糖生产的研究还十分匮乏，其培养条件和影响因素还需要更深层次的研究。

传统海藻资源的培养成本普遍偏高，且培养体系单一、传统、耗时较长。其中，采用高效液相色谱法从海带中分离提取多糖，提取过程比较复杂且耗能较高;龙须菜、海葡萄的提取方式复杂、耗时长且培养体系单一，会造成资源的浪费。海洋微藻培养工艺先进，多糖生产成本低，因此建立海藻制药-制药废水培养微藻的全链条机制，构建海洋生物制药废水利用—海洋微藻培养—海洋微藻多糖制药的生物地球化学循环全链条网络，不仅可以降低微藻培养成本，还能大大节约自然资源（表1）。

2 药用海藻资源的培养

目前利用基因工程与细胞工程等生物技术手段提高海藻多糖含量是海洋生物医药领域的攻关热点，其中聚焦于基因调控、氮源饥饿、底部沉积物组分调整等有效手段[29-37]（表2）

2.1 基因调控

海藻对海洋生态系统至关重要，具有重大的经济价值。537-Mb组装的基因组序列覆盖估计基因组的98.5%，预测和注释18733个蛋白质编码基因，与细胞壁合成、发育和防御系统相关的基因家族得到扩展。实验表明，控制多糖合成是一大类基因簇，因此通过基因调控可以促进多糖的积累[29]。

双高-y-亚麻酸（DGLA）具有极强的抗炎活性，但人们知之甚少。研究发现在细菌脂多糖（LPS）刺激下，DGLA 对白细胞介素、一氧化氮和总活性氧的产生具有抑制作用，以协同方式减弱LPS诱导的关键炎症基因的表达;结果表明，微藻衍生的富含DGLA 的乙酯（30%）表现出与DGLA 乙酯类似的活性，有利于多糖的积累，增强微藻作为这种罕见抗炎脂肪酸的有效来源的潜力[30]。代谢组与转录组分析的结合有助于了解基因功能及其在各种代谢途径中的调节，mRNA（基因）和靶向代谢产物之间的共表达匹配决定其同源表达，通过基因调控促进多糖的积累，这导致基因调控网络与特定代谢途径之间关系被发现，为代谢工程在海藻中产生特定代谢产物开辟新途径，有利于药用海藻资源的培养[31]。通过研究暴露于不同波长的光和CO₂有效性下的海藻的光合作用机制，发现在CO₂ 浓度高时，编码C₃和C₄酶的基因被转录，这表明碳代谢途径可能发生改变，或者这些基因参与适应性生理过程，这都会促进多糖的积累，从而提高多糖产量，可被用于海洋生物制药行业;这项研究有助于理解红藻光合碳代谢的调节机制，并对这些具有经济价值的大型藻类的培养和商业生产具有重要意义[32]。

2.2 氮源饥饿

氮是最重要的营养元素之一，是植物和藻类生长发育所必需的。Liu等[33]通过实验发现氮缺乏是有效的环境胁迫，用于增加藻类代谢产物的积累;生理指标表明，氮胁迫降低氨基酸和蛋白质的生物合成，提高内源NH4+ 和可溶性多糖水平，为多糖积累奠定基础。

氮限制可以诱导微藻中性脂质积累，并抑制其生长。Yang等[34]用不含NaNO3 的f/2-Si培养基清洗微藻2次，完全去除氮，然后再转移到烧瓶中培养;实验发现在缺氮条件下，1213个基因（包括关键的碳固定、TCA 循环、甘油脂代谢和氮同化基因）的表达水平增加。因此，利用氮源饥饿原理，采取基因调控方式可以改善微藻生化组分的生产，可以调控编码多糖酶的基因来促进多糖的积累。

褐藻水溶性多糖作为重要的生物技术高分子材料，越来越受到研究者的关注。Skriptsova[35]通过光生物反应器进行丝状褐藻（Streblonemasp.）的培养，提出水溶性多糖的新来源;在氮源饥饿的条件下，其可以获得较高的多糖积累和生物质含量，从而积累大量的水溶性多糖（WSPs）;氮源的限制可以刺激海藻具有高水溶性多糖产量的积累。

2.3 底部沉积物组分调整

底部沉积物对海藻资源的培养有一定的影响，即对海藻营养成分积累有一定的影响。

Long等[36]分析和比较在有和没有底部沉积物的情况下生长的海藻样品中的蛋白质、氨基酸、脂类、脂肪酸、碳水化合物和矿物质以及多糖的单糖组成，结果表明海底沉积物的存在增加海藻中灰分、矿质元素和多糖的含量，对蛋白质、脂质、饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸的含量和多糖的单糖组成没有显著影响，这为海藻作为药用资源的进一步开发利用提供科学依据。Huang等[37]通过实验室实验和现场观测相结合，在实验室用M11培养基培养铜绿微囊藻，并置于照明培养箱中，研究发现对底部沉积物进行低到中浓度的扰动有利于多糖的积累。

3 海藻生物制药的环境保障

3.1 海洋生物制药废水对环境的威胁

海洋生物制药废水的特点是成分复杂，污染物具有浓度高、浊度高、生物降解性低、毒性强等特点。其中，进水水质中COD 的浓度大约为6000mg/L，氨氮的浓度大约为200mg/L，TN 的浓度大约为250 mg/L，TP 的浓度大约为10mg/L[38]，具有高COD、高氨氮与TN、高色度、成分复杂等特点。Tiwari等[39]通过研究发现海洋生物制药过程中会排放废水和污染物进入环境，会使地表水和地下水的水质恶化。

制药行业通过使用有机和无机化合物作为原料生产各种各样的物质，从而产生大量有毒和复杂的有机液体废水，会对环境造成一定的破坏[40]。可吸附有机卤素（AOX）是含有有机键合卤素的化合物总量的一般指标，存在于海洋生物制药废水中。Xie等[41]通过研究中国4家大型制药厂中AOX 的浓度和组分，发现这4家工厂废水的AOX 浓度在4.6～619.4mg/L 之间;如果将这些制药废水直接排放，会对环境造成严重的破坏。

3.2 海洋生物制药废水利用

海洋生物制药废水产生的富含碳的液体废物一般被认为是有害的。Hosseini等[42]通过研究发现大部分废液可以用于生物脱氮，作为生活污水处理中反硝化的碳源，也可用于厌氧沼气的生产。

Liang等[43]以某制药厂二次生物处理流出物为研究对象，通过混凝、超滤、反渗透处理等水回用试验的核心技术对废水进行处理，结果表明反渗透在高水通量下运行平稳，海水淡化效果逐步优化，混凝、超滤、反渗透在医药废水回用工程中的应用有效，反渗透的流出物可用于最先进的制药工艺。

Zhang等[44]在一系列类似Fenton的系统中对生物制药废水进行批量实验，为达到20%的COD去除率，最佳条件是pH 值为3.0、Fe₃O₄ 用量为1.0g/L、H₂O₂用量为10mg/L，FeO 和Fe²⁺不仅提高COD的去除率、减少铁污泥，而且促进催化剂的再利用，实现海洋生物制药废水的再利用。抗生素制药废水的排放造成严重的环境问题，Guo等[45]通过好氧工艺、厌氧工艺、厌氧-好氧工艺和其他组合工艺对抗生素废水进行降解，做到对废水的重复利用。

海 洋生物制药行业产生的VOCs和恶臭可分为4类：发酵尾气、回收废气、车间废气和废水恶臭。通常用冷凝法作为预处理对高浓度废气进行净化处理，从而降低有机负荷，达到回收有机物的目的[46]。

综上所述，目前海洋生物制药废水的处理主要依赖于混凝、超滤、反渗透、厌氧、好氧等处理工艺，程序复杂，能耗较高。能否利用海洋生物制药废水中丰富的有机碳源、氮源作为微藻培养的营养源，实现海洋生物制药废水的资源化利用，成为制药废水利用领域的攻关热点;海洋生物制药废水中丰富的有机碳源如何有效调控海洋微藻细胞内的多糖积累，成为海洋生物制药领域的攻关难题。

3.3 建立海藻制药- 制药废水培养微藻的全链条机制

海洋生物制药废水除可以作为污水处理中反硝化的碳源、经处理成为回用水之外，其含有海藻生长所必需的碳氮磷等营养元素。因此，可利用海藻制药产生的废水反过来继续培养海藻，实现海藻培养产糖与海藻制药废水处理的有效集成，构建海洋生物制药废水利用—海洋微藻培养—海洋微藻多糖制药的生物地球化学循环全链条网络（图1）。

4 结语

与大型海藻相比，海洋微藻具有种类繁多、培养工艺先进、多糖生產成本低等优势，是亟待挖掘和开发的有潜力的海洋生物医药的种质资源。

利用基因调控、氮源饥饿、底部沉积物组分调整等手段的研究主要聚焦于海藻细胞内多糖化合物的积累，其背后的调控机制很少涉及。针对海洋生物制药废水处理成本高的问题，可构建海洋生物制药废水利用—海洋微藻培养—海洋微藻多糖制药的生物地球化学循环全链条网络，切实推动海洋强国建设;针对调控海洋微藻细胞内多糖积累研究的局限，探明海洋生物制药废水中的丰富碳源对多糖积累的调控机制，对实现多糖产出最大化提供重要的理论指导。