lncRNA UASR1 和miR-144 在胰腺癌组织中的表达及临床意义

王 琼 赵 静 巩 婷 吕 颖

胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤，近年来其发病率呈升高趋势，因患者早期症状不典型，常错过最佳治疗期[1]。因此，发现并筛选胰腺癌早期诊断及预后预测的潜在生物标志物，对于胰腺癌治疗方案的确定具有重要意义。长链非编码RNA（lncRNA）和miRNA 是目前被广泛研究的非编码RNA，其表达失调与包括肿瘤在内的多种疾病的发生和发展密切相关[2-4]。研究表明，lncRNA UASR1 在结直肠癌组织中表达上调，并作为miR-107 的分子海绵促进结直肠癌细胞增殖[5]；此外，lncRNA UASR1 在口腔鳞状细胞癌组织中过表达，通过调节miR-375/酪氨酸蛋白激酶2 （JAK2）信号通路促进肿瘤细胞增殖[6]。研究表明，miR-144通过抑制肝细胞生长因子 （HGF）表达而抑制肝细胞癌（HCC）细胞增殖，并作为抑癌因子延缓HCC 进展[7]。另有研究表明，miR-144-3p 在胰腺癌组织中呈低表达，可以通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路靶向富含脯氨酸的蛋白11（PRR11），诱导胰腺癌细胞周期阻滞和细胞凋亡[8]。目 前 有 关lncRNA UASR1 和miR-144 在 胰 腺 癌 组织中的表达水平及其临床意义的研究报道较少。本研究通过分析胰腺癌组织中lncRNA UASR1 和miR-144 的表达水平与患者临床病理特征的关系，探究两者对胰腺癌的诊断和预后预测的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2018 年3 月至2019 年3 月中国人民解放军联勤保障部队第九四一医院收治的胰腺癌患者作为研究组，并将同期在该院治疗的胰腺良性病变患者作为对照组。研究组纳入标准：（1）所有患者均符合《胰腺癌综合诊治指南（2018 版）》[9]中的诊断标准，并经病理组织学确诊为胰腺癌；（2）所有患者均为初次治疗；（3）病历资料完整；（4）近6 个月内未服用激素类药物。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤者；（2）有复发或远处转移者；（3）合并严重自身免疫病者；（4）合并严重血液传染病者；（5）有精神类疾病，依从性差或随访失访者；（6）妊娠期或哺乳期妇女。对照组为需行切除手术的胰腺良性囊肿患者。所有入组患者及家属均签署知情同意书，且本研究经医院医学伦理委员会批准。

根据纳入和排除标准，研究组共纳入了95 例患者，其中男性59 例，女性36例，年龄36～73 岁，平均年龄为（57.39±9.84）岁。对照组共纳入了56例患者，其中男性31 例，女性25 例，年龄30～71岁，平均年龄为（56.27±8.45）岁。2 组的年龄、性别差异均无统计学意义（P均＜0.05），具有可比性。

1.2 lncRNA UASR1 和miR-144 的表达水平检测

研究组的手术方案包括根治性胰十二指肠切除术、根治性胰体尾联合脾脏切除术、全胰腺切除术或联合动静脉切除术等，术中获取胰腺癌组织；对照组行胰腺节段切除术等，直接切取肿块组织。所有手术均由同组经验丰富的医师完成，获取组织后置于-80 ℃冰箱中保存。组织在液氮中研磨后，取100 mg 样品加入1 mL TRIzol 试剂（购自美国Invitrogen 公司），提取总RNA。应用Nanodrop 2000 紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和浓度。取1 μg 总RNA，使用反转录试剂盒[miRcute 增强型miRNA cDNA 第一链合成试剂盒和lnRcute lncRNA cDNA 第一链合成试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司]将其反转录为cDNA。

采用实时荧光定量PCR 法检测lncRNA UASR1和miR-144 的表达水平。按照试剂盒[miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒和lnRcute lncRNA 荧光定量检测试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司]说明书操作，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，miR-144 以U6 为内参，lncRNA UASR1 以GAPDH 为内参，引物序列见表1。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；之后95 ℃变性15 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，共计40 个循环。采 用2-△△Ct法计算lncRNA UASR1 和miR-144 的相对表达量。

表1 引物序列

1.3 随访

采用电话和门诊复查的方式对研究组进行随访，随访起始时间为患者首次治疗出院后，每3 个月随访1 次，随访截至2022 年3 月或患者死亡。

1.4 统计学分析

应用SPSS 23.0 和Origin 9.1 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用ROC 曲线评估lncRNA UASR1 和 miR-144 的 表 达 水 平 对 胰 腺 癌的诊断价值。采用Kaplan-Meier 法分析lncRNA UASR1 和miR-144 的表达水平与胰腺癌患者术后生存期的相关性。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组和对照组患者lncRNA UASR1 和miR-144 表达水平比较

研究组的miR-144 相对表达量为0.68±0.28，显著低于对照组（1.35±0.36），差异有统计学意义（t＝-7.594，P＜0.001）。研究组的lncRNA UASR1 相对表达量为2.38±0.32，显著高于对照组（1.21±0.57），差 异 有 统 计 学 意 义（t＝8.326，P＜0.001）。

2.2 lncRNA UASR1 和miR-144 的表达水平对胰腺癌的诊断价值分析

ROC 曲线分析结果显示，miR-144 表达水平诊断胰腺癌的曲线下面积（AUC）为0.850（95%CI：0.789～0.910），敏感度为63.9%，特异度为91.1%；lncRNA UASR1表达水平诊断胰腺癌的AUC为0.831（95%CI：0.766～0.896），敏感度为70.1%，特异度为94.6%；2 项联合检测诊断胰腺癌的AUC 为0.945（95%CI：0.913～0.977），敏感度为83.5%，特异度为92.9%。见图1。

图1 lncRNA UASR1 和miR-144 的表达水平诊断胰腺癌的ROC曲线

2.3 lncRNA UASR1 和miR-144 的表达水平与胰腺癌患者临床病理特征的关系

以lncRNA UASR1 相对表达量的中位数将患者分为lncRNA UASR1 高表达组（≥2.06，49 例）和lncRNA UASR1 低表达组（＜2.06，46例）；以miR-144 相对表达量的中位数将患者分为miR-144 高表达组（≥0.68，42 例）和 miR-144 低表达组（＜0.68，53 例）。结 果 显 示，lncRNA UASR1 的 表 达 水 平与淋巴结转移、血管侵犯、TNM 分期均有关（P均＜0.05），miR-144 的表达水平与肿瘤直径、淋巴结转移、血管侵犯、分化程度、TNM 分期均有关（P均＜0.05）。见表2。

表2 lncRNA UASR1 和miR-144 的表达水平与胰腺癌患者临床病理特征的关系/例（%）

2.4 lncRNA UASR1 和miR-144 的表达水平与胰腺癌患者术后生存期的关系

随访结果显示，lncRNA UASR1 低表达组的平均生存期为（19.69±1.20）个月，显著长于lncRNA UASR1 高表达组[（14.78±0.75）个月]，差异有统计学意义（χ2＝12.887，P＜0.001）；miR-144 高表达组的平均生存期为（18.65±1.10）个月，显著长于miR-144 低表达组[（15.94±0.78）个月]，差异有统计学意义（χ2＝8.003，P＝0.005）。见图2。

图2 lncRNA UASR1 和miR-144 的表达水平与胰腺癌患者生存情况的关系 A miR-144 B lncRNA UASR1

3 讨论

胰腺癌早期症状不典型，起病隐匿且发展迅速，导致患者确诊时疾病多已进展至晚期，预后较差，患者的中位生存时间为3～5 个月[10-11]。非编码RNA 参与肿瘤生长和免疫监视逃逸相关基因的表达调控，但其在胰腺癌发生和进展中的潜在机制仍未完全明确。

miRNA 通过与目的基因mRNA 的3'UTR 结合，导致mRNA 降解或翻译抑制，从转录和转录后水平影响目的基因的表达。lncRNA 可作为miRNA 的分子海绵，共同调控细胞增殖、炎性因子分泌、细胞凋亡、细胞迁移等细胞生物学行为，进而影响肿瘤进展[12-16]。lncRNA 和miRNA 对胰腺癌的诊断和预后预测的价值及其作用机制是目前的研究热点，不同的lncRNA 和miRNA 作为抑癌基因或促癌基因影响胰腺癌的发生和发展。研究表明，lncRNA DANCR 在胰腺癌组织和细胞中表达上调，miR-33b 表达下调，且DANCR 可以与miR-33b 靶向结合，调控MMP16 的表达，形成lncRNA-miRNA-mRNA功能网络，为胰腺癌提供新的潜在治疗靶点[17]。

研究表明，结直肠癌组织中lncRNA UASR1表达上调，其可通过调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路促进结直肠癌细胞增殖[18]；Cao 等[19]研 究 发 现，lncRNA UASR1 可 通 过 调 控蛋白激酶B（Akt）/mTOR 信号通路促进乳腺癌细胞的增殖和迁移。本研究结果显示，胰腺癌组织中lncRNA UASR1 表达上调，其对胰腺癌的诊断具有一定价值；lncRNA UASR1 的表达水平与患者淋巴结转移、血管侵犯及TNM 分期有关，且lncRNA UASR1 高表达患者的预后较差。研究表明，miRNA 可以通过沉默促癌基因或通过靶向肿瘤蛋白而作为肿瘤抑制剂[20]。Manasa 等[21]的研究发现，miR-144 在口腔癌细胞系中表达下调，且共表达miR-144/451a 后显著降低了细胞的迁移、侵袭能力。王开琼等[22]的研究表明，miR-144 在胰腺癌SW1990 细胞中表达下调，而上调miR-144 表达可有效抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。本研究结果显示，胰腺癌组织中miR-144 表达下调，且miR-144 的表达水平诊断胰腺癌的AUC 为0.850，其与lncRNA UASR1 联合检测诊断胰腺癌的AUC为0.945，这提示联合检测对胰腺癌的诊断效能较高。此外，本研究结果显示miR-144 的表达水平与患者淋巴结转移、肿瘤直径、肿瘤分化程度、血管侵犯及TNM 分期有关，且miR-144 可以作为胰腺癌预后预测的有效指标。

综上所述，胰腺癌组织中lncRNA UASR1 表达上调，miR-144 表达下调，两者对胰腺癌的诊断和预后预测具有一定的价值。今后本课题组将检测胰腺癌患者血清lncRNA UASR1 和miR-144 的表达水平，判断两者是否可以作为胰腺癌早期诊断的血清标志物，并进一步探究两者在胰腺癌发生和发展中的分子机制。