利用西瓜愈伤组织快速检测CRISPR/Cas9基因编辑效率
2023-05-27彭婷刘曼刘春宇王家发田树娟袁黎
彭婷 刘曼 刘春宇 王家发 田树娟 袁黎
摘 要：西瓜作为重要的园艺经济作物，其CRISPR/Cas9基因编辑效率的快速检测方法仍十分匮乏。以愈伤组织再生能力强的野生西瓜种质ZTC为试验材料，针对西瓜ClPDS基因构建CRISPR/Cas9双靶点敲除载体，利用农杆菌侵染西瓜幼嫩子叶，在含1.0 mg·L-12，4-二氯苯氧乙酸生长素的MS培养基中诱导愈伤组织形成，通过绿色荧光蛋白标记筛选阳性愈伤组织，检测其编辑效率。结果表明，2个靶点均发生基因编辑，靶点1处的编辑效率为42.95%，靶点2处的编辑效率为29.92%。在愈伤组织中建立了西瓜生长发育早期有效基因编辑效率检测体系，为后续编辑株系的确定节约了大量时间，为基因编辑技术应用于西瓜重要农艺性状改良及优异种质创制提供了技术支撑。
关键词：西瓜；CRISPR/Cas9；愈伤组织；编辑效率检测
中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）05-029-08
Rapid CRISPR/Cas9 efficiency testing by transient transformation in watermelon callus
PENG Ting， LIU Man， LIU Chunyu， WANG Jiafa， TIAN Shujuan， YUAN Li
（State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas/College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China）
Abstract： The simple and effective system to test CRISPR/Cas9 gene editing efficiency has not been established in watermelon， an important horticultural cash crop. In this study， the wild watermelon germplasm ZTC with strong callus regeneration ability was used as the material， and the CRISPR/Cas9 dual-target knockout vector was constructed to target the watermelon ClPDS gene. The watermelon young cotyledons were infested with Agrobacterium strain EHA105， then these incubated explants were cultivated in callus induction media. The positive callus was screened by green fluorescent protein label， and the editing efficiency of target sites were further tested by deep sequencing respectively. The results showed that the target 1 and target 2 had been mutated， and the total editing efficiency of target 1 and target 2 were 42.95% and 29.92%， respectively. Thus， a simple and rapid testing system of gene editing efficiency was established in watermelon callus during the early development stage， which saves time and labor for the subsequent experiment， and also provided a basic technical support for future watermelon CRISPR/Cas9 gene editing technology application.
Key words： Watermelon; CRISPR/Cas9; Callus; Editing efficiency testing
基因編辑技术是目前分子育种3.0时代的核心技术，是进行作物性状改良及新种质创制的关键技术。其中，CRISPR/Cas9基因编辑系统因设计简单、操作方便等诸多优点成为当下应用最为广泛的基因编辑工具之一，在植物生长发育、果实品质、响应生物与非生物胁迫研究方面发挥重要作用[1]。该工具主要是通过sgRNA和Cas9蛋白完成对基因组DNA双链的识别和切割，在细胞内实现基因定点修饰，激发细胞自身的修复机制，DNA在修复的过程中造成核苷酸序列改变从而实现基因编辑[2-3]。随着对CRISPR/Cas9系统研究的不断深入，发现该系统在工作过程中存在编辑效率低或无法正常编辑的情况，导致在转基因阳性植株筛选过程中无法获得正确编辑的突变体或突变体多为嵌合体等一些缺点[4-5]。因此，寻找早期快速、准确地检测编辑效率的方法已成为降低研究者工作量、提高工作效率、精准鉴定后期突变体表型的迫切需求。
植物中早期快速检测基因编辑效率的研究报道较少。张月乔等[6]利用西瓜不定根测定CRISPR/Cas9载体中所选靶点的可行性；杨孟霞等[7]通过发根农杆菌转化番茄子叶产生毛状根，提取转基因毛状根基因组DNA检测CRISPR/Cas9多靶点载体的编辑效率。通常情况一条不定根是由一个细胞发育形成的，导致检测编辑效率时需要采取大量根部样品，以保证编辑效率的准确性。在水稻[8]、玉米[9]和拟南芥[10]中可以利用其原生质体细胞检测CRISPR/Cas9系统的编辑效率，该方法主要利用PEG将构建的基因敲除载体转化原生质细胞，通过显微镜统计转基因细胞的比例，然后提取转化后原生质体的DNA检测编辑效率。原生质体检测编辑效率时样品由无数单一细胞构成，满足检测样品数量多的条件，但该方法涉及原生质细胞的提取、转化以及培养等繁琐过程，导致试验可控性和稳定性较差。当CRISPR/Cas9系统应用于梨树研究时，由于梨组培苗的再生率低，杨锋等[11]在梨愈伤组织中建立高效的基因编辑体系并检测该系统的编辑效率。愈伤组织细胞检测方式是采用农杆菌介导的遗传转化方法侵染植物外植体，在特定条件下诱导愈伤组织细胞团的形成，挑取转基因愈伤组织细胞检测基因编辑效率。因此，利用愈伤组织早期快速检测编辑效率的方法克服了不定根检测法效率检测准确率低的问题，同时克服了原生质体法可控性差、稳定性差的缺点，是目前较理想的编辑效率检测方法。
西瓜（Citrullus lanatus）为葫芦科西瓜属的一年生蔓生植物，因其清爽解渴，营养价值丰富，是夏季防暑降温必备水果，是我国重要的经济园艺作物之一[12-13]。2017年，许勇团队将CRISPR/Cas9技术成功地应用于西瓜物种中，定向敲除西瓜白化基因，同时利用西瓜原生质检测该系统的编辑效率[14]。然而，利用愈伤组织快速准确检测基因编辑效率在西瓜中的应用待进一步研究。针对西瓜稳定遗传转化周期长、培养过程复杂和西瓜原生质体细胞不易提取和培养等问题[15-16]，笔者以愈伤再生能力强的野生型西瓜种质ZTC为材料，采用农杆菌介导的遗传转化方法侵染幼嫩子叶外植体并诱导愈伤组织形成，通过西瓜愈伤组织细胞检测CRISPR/Cas9基因编辑效率，在西瓜中建立一种简单快速的CRISPR/Cas9基因编辑效率的检测方法，为其他葫芦科作物及植物编辑效率快速检测提供技术基础，具有重要的理论意义和实践价值。
1 材料与方法
1.1 材料
野生型种质ZTC，生长于关中平原与黄土高原过渡区域。由于ZTC可进行高效稳定的遗传转化以及该种质的愈伤再生能力强，因此选择野生型西瓜种质ZTC为材料展开研究。试验材料于2021年3－8月种植于西北农林科技大学园艺学院杨凌西甜瓜示范基地的塑料大棚，2021年10月收取种子用于后续试验。由西北农林科技大学西甜瓜课题组提供CRISPR/Cas9基因编辑载体pBSE402和pCBC-DT1T2[17-18]。大肠杆菌（E. coli）DH5ɑ菌株和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105购于上海唯地生物技术有限公司
1.2 CRISPR/Cas9双靶点敲除载体的构建
（1）用限制性内切酶BsaI 酶切pBSE402载体，得到线性化载体。反应体系为：2 ?g pBSE402质粒，5.0 ?L 10×CutSmart Buffer，1.5 ?L BsaI-HF，补充dd H2O至50 ?L的反应体系，37 ℃酶切45 min。
（2）使用文献报道的西瓜PDS基因ClPDS（Cla010898）的2个靶点作为编辑效率检测靶点[14]，以ClPDS-F/R为引物，pCBC-DT1T2载体为模板，使用高保真酶进行PCR扩增，该PCR产物的5和3最末端的序列分别与pBSE402线性化载体两末端序列完全一致。
（3）使用天根通用型DNA纯化回收试剂盒回收纯化上述获得的线性化载体和PCR产物后，通过同源重组方法进行连接，取10 μL连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，检测阳性克隆，测序正确后提取大肠杆菌质粒，获得正确的重组质粒pBSE402-PDS。
（4）吸取2 μL pBSE402-PDS重组质粒加入100 μL的农杆菌EHA105感受态细胞，冰上5 min，液氮5 min，37 ℃ 5 min，冰上5 min后加入500 μL LB液体培养基，200 r?min-1 28 ℃ 3 h后，5000 r?min-1离心5 min，倒上清液400 μL，将剩余100 μL液体与底部菌液吸打混匀，涂布在50 mg·L-1卡那霉素和20 mg·L-1利福平LB固体培养基上，28 ?C培养2～3 d。挑取PCR验证后的单菌落至10 mL 50 mg·L-1卡那霉素和20 mg·L-1利福平的LB液体培养基中，在200 r?min-128 ℃的摇床上摇至OD600=0.8。
1.3 西瓜愈伤组织编辑效率统计方法
1.3.1 西瓜愈伤组织遗传转化方法 西瓜愈伤组织的遗传转化主要是参照西瓜遗传转化过程和愈伤诱导培养条件[19-20]，具体步骤如下：
（1）外植体制备：准备20粒ZTC种子，55 ?C 温汤浸种30 min，剥去种壳；在超净台中将种子在75%乙醇浸泡30 s，灭菌水清洗3遍，3%次氯酸钠浸泡15 min，然后用灭菌水清洗5～6遍，灭菌滤纸上晾干；平放到播种培养基（琼脂Agar powder 6.4 g·L-1），于28 ?C黑暗條件下生长2～3 d；待下胚轴长至5 mm左右时，在超净台中将每粒种子2片子叶分别切成4块，即为制备好的外植体。
（2）外植体侵染：在20 mL无菌注射器中加入10 mL MS液（M519 4.43 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+6-BA 1.5 mg·L-1+40.0 mg·L-1乙酰丁香酮），取1 mL OD600=0.8的菌液加入MS液体中制成侵染液；将制备好的外植体浸泡在侵染液中，抽真空15 min；弃侵染液，取出外植体平铺在灭菌滤纸上晾干。
（3）愈伤的组织培养：将晾干外植体移至含有1.0 mg·L-12，4-D的MS固体培养基（M519 4.43 g·L-1+蔗糖30.00 g·L-1 + 琼脂G3251 3.00 g·L-1+200 mg·L-1TMT）并调pH值为6.0以诱导愈伤组织。
1.3.2 西瓜愈伤组织编辑效率检测方法 使用体视荧光显微镜挑取发荧光的愈伤细胞，取20个独立愈伤组织细胞团混合成为1个样品，共计3个重复。采用CTAB法提取发荧光愈伤组织DNA，设计引物PDS-F1/R1、PDS-F2/R2扩增含靶点的ClPDS基因序列送Sanger测序，设计引物PDSd-F1/R1、PDSd-F2/R2扩增包含靶点的ClPDS基因序列送深度测序（Hi-TOM），检测靶点编辑效率以及编辑类型[21]（表1）。
1.4 西瓜遗传转化效率统计方法
外植体制备和外植体侵染参照西瓜愈伤组织遗传转化中外植体制备和侵染过程，不定芽的组织培养：将晾干外植体移至含有1.0 mg·L-16-BA的MS固体培养基（M519 4.43 g·L-1+蔗糖30.00 g·L-1+琼脂G3251 3.00 g·L-1+ 200 mg·L-1TMT）并调pH值为6.0；3周后统计侵染外植体子叶块的数目和阳性不定芽的数目，遗传转化效率/%=阳性不定芽数目/外植体数目×100，1个载体进行3次独立的遗传转化过程，分别统计每次遗传转化时外植体子叶块的数目和阳性不定芽的数目。
1.5 数据处理
利用Microsoft Excel 2020进行数据处理和图表绘制。
2 结果与分析
2.1 CRISPR/Cas9双靶点载体的构建
根据文献报道西瓜ClPDS（Cla010898）基因的2个靶点，构建pBSE402双靶点敲除载体（图1-A），2个靶点分别位于第1个和第3个外显子上，第一个靶点的GC含量为65%（图1-B），第二个靶点的GC含量为47%（图1-C）。
根据pBSE402双靶位点的构建原则设计含有靶点的引物序列ClPDS-F/R，以pCBC-DT1T2载体为模板，进行PCR扩增，扩增产物中有4个片段包括sgRNA1/U6-26t/U6-29p/sgRNA2，目的片段大小为622 bp（图2-A）。使用限制性内切酶BsaI酶切pBSE402载体，切除片段大小为1225 bp（图2-B）。将上述扩增片段和酶切载体胶回收纯化，使用同源重组酶连接，将连接产物通过热激法转化大肠杆菌，设计引物U6-26F和U6-29R检测阳性克隆，条带大小为626 bp（图2-C），表明重组载体构建成功，提取质粒，使用U6-26F1引物进行Sanger测序，将测序正确的质粒通过热激法转化农杆菌感受态EHA105，使用U6-26F和U6-29R再次鉴定阳性单克隆，表明该质粒已经成功转化农杆菌菌株EHA105（图2-D）。
2.2 基于西瓜不定芽的CRISPR/Cas9遗传转化效率统计
通过西瓜阳性不定芽检测CRISPR/Cas9编辑载体pBSE402的转化效率，首先使用pBSE402-PDS/EHA105农杆菌侵染西瓜外植体子叶块，放置于含有1 mg·L-16-BA的MS固体培养基中恢复培养3周后（图3），分别统计3次独立侵染外植体的数量和阳性不定芽的数量，统计结果显示，pBSE402载体的遗传转化效率为4.75%（表2）。
2.3 基于西瓜愈伤组织细胞的CRISPR/Cas9编辑效率检测
通过西瓜阳性愈伤组织实现CRISPR/Cas9编辑效率快速检测，首先使用pBSE402-PDS /EHA105农杆菌侵染西瓜外植体子叶块，在28 ℃黑暗环境下共培养3 d（图4-A～B），放置于含有1 mg·L-1 2，4-D的MS固體培养基中进行培养，诱导愈伤组织细胞形成（图4-C～D）。如图4-C所示，在体式荧光显微镜下挑取GFP荧光蛋白表达的愈伤组织，提取20个独立阳性愈伤组织混合作为1次重复，提取愈伤DNA进行基因编辑效率分析，设置3次生物学重复。
在sgRNA和Cas9基因的序列上分别设计U6-26F/U6-29R和Cas9 F/R引物，检测转基因愈伤组织中是否有T-DNA的插入。PCR结果表明，愈伤组织样品的DNA中U6-26F/U6-29R引物扩增片段为626 bp，Cas9 F/R引物扩增片段为481 bp，均检测到sgRNA片段和Cas9基因片段（图5-A～B），表明pBSE402载体的T-DNA序列成功插入到西瓜基因组中。
设计引物PDS-F1/R1、PDS-F2/R2扩增含靶点1和靶点2的ClPDS基因序列进行Sanger测序。普通测序结果表明，3个样品均在靶点1处出现明显双峰，在靶点2处未出现双峰现象（图6-A）。然后设计深度测序引物PDSd-F1/R1、PDSd-F2/R2扩增包含靶点1和靶点2的ClPDS基因序列进行深度测序。深度测序统计结果显示，靶点1和靶点2的编辑效率分别为42.95%和29.92%（表3），表明在靶点1和靶点2处均发现编辑形式，其中靶点1存在6种编辑形式，涉及2～6个碱基的缺失，其中以3个碱基GTG的缺失为主要形式。靶点2也存在6种编辑形式，涉及1～6个碱基的缺失，其中以1个碱基C的缺失为主要形式（图6-B）。
3 讨论与结论
目前CRISPR/Cas9基因编辑技术已经广泛应用于小麦[22]、玉米[23]、水稻[5]、大豆[24]和番茄[25]等作物中，随着科学技术的持续发展，基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术及其衍生的新型基因编辑工具将在作物定向分子设计育种应用中发挥重要作用，能为农业生产培育高产和优质的创新作物种质资源。基因编辑效率的检测是CRISPR/Cas9系统成功应用于作物中的重要前提，在进行大量遗传转化之前，应当先进行靶点编辑效率的检测，确定靶点是否能够工作以及该靶点的编辑效率，从而减少人力和物力的浪费。2017年，许勇团队成功将基因编辑技术应用到西瓜物种中，利用西瓜原生质体检测CRISPR/Cas9编辑效率，但该方法涉及植物原生质体细胞的提取、侵染和培养过程，对植物生长状态和实验操作过程要求较高，导致试验的稳定性和可控性差[14]。愈伤组织是植物的某些器官或组织在合适的培养条件下产生的具有旺盛分裂能力的薄壁细胞，具有细胞数量大，培养周期短等优点[26]。愈伤组织再生能力主要是由植物基因型所决定的，同时也受外源激素和培养基选择等外在因素的影响[27]。前期试验通过探析不同西瓜种质愈伤的再生能力，发现ZTC野生种质的愈伤组织再生能力较强，因此选择该种质作为此次试验的材料。
笔者构建了pBSE402-PDS双靶点基因敲除载体，采用农杆菌介导的方法侵染西瓜外植体，通过西瓜阳性不定芽来统计pBSE402-PDS载体的遗传转化效率。结果表明，遗传转化效率为4.75%，与Feng等[20]研究结果相符。利用深度测序检测到阳性愈伤基因组靶点１和靶点2处的编辑效率分别为42.95%和29.92%，表明该方法具有可行性。有研究表明，玉米[28]、水稻[29]等植物，可以通过对不断继代的愈伤进行侵染，然后进行脱分化和再分化，培养出完整的转基因植株，笔者在研究中提出了完善的愈伤组织培养方法也为未来通过诱导西瓜愈伤组织分化形成完整的转基因植株提供了技术支撑。
笔者的研究针对西瓜的遗传转化体系过程复杂、周期长以及原生质体细胞操作困难的问题，在西瓜愈伤组织中建立一种简单、快速、方便的西瓜CRISPR/Cas9基因编辑效率检测方法，避免在后续试验中出现靶点不工作、靶点工作效率低等情况，对加快后期基因功能研究和作物遗传育种研究具有重要意義。
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