金莲清热泡腾片抗流感病毒体内外药效实验及作用机制研究

崔南南 耿丽波 王虹艳 窦啟玲 窦雅琪

1.天津市海河医院，天津 300000；2.贵州益佰制药股份有限公司，贵州贵阳 550000

流行性感冒是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。典型的临床症状为急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。该病由流感病毒引起，可分为甲、乙、丙、丁四型，其中甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大、传播迅速，极易发生大范围流行[1-2]。

抗病毒治疗是流感治疗的主要策略，主要抗病毒药物有奥司他韦、扎那米韦等。这类药物在有效治疗流感的同时，不良反应较大，且容易产生耐药性，限制其临床应用，特别是儿童[3]。金莲清热泡腾片为泡腾片中药剂型，具有清热解毒，利咽生津，止咳祛痰等功效。主治外感热证，症见高热、口渴、咽干、咽痛、咳嗽、痰稠，亦适用于流行性感冒、上呼吸道感染有上述证候者[4]。本研究针对金莲清热泡腾片治疗流感的系统药效学进行研究，为金莲清热泡腾片临床用于流感治疗提供依据。

1 材料

1.1 细胞及病毒株

狗肾（madin darby canine kidney，MDCK）细胞，引自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

甲1 型 流 感 病 毒NYMCX-179A 株、甲3 型流感病毒NYMCX-327 株和乙型流感病毒株（B/Phuket/3073/2013）均购自英国国家生物制品检定。

1.2 实验动物

BALB/c 雌性小鼠（SPF 级），体重12 ～15 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[生产许可证号：SCXK（京）2019.0008]。本实验所有实验动物均严格遵循《实验动物的使用管理程序》，并于生物安全实验室（BSL.Ⅱ）中完成。

1.3 药物及试剂

金莲清热泡腾片未加辅料的浸膏36.37 g（批号：1912014）、金莲清热泡腾片（国药准字Z20103076，规格：4 g/片，批号：1912030），天津中盛海天制药有限公司生产；奥司他韦（达菲）（国药准字J20140121，规格：75 mg，批号：SOT-190704），上海罗氏制药有限公司；Influenza A Virus H1N1 HA antibody，武汉赛维尔；Biotin-conjugated AffiniyureGaot Anti-Mouse IgG（H+L），武汉三鹰。

2 方法

2.1 体外抗流感药效实验

预防模式MDCK 细胞加入受试药TD0浓度（5 mg/ml）作连续2 倍系列稀释的高、中、低3 个浓度，孵育2 h，加入病毒吸附2 h 后，加入MEM培养基；治疗模式加入100 病毒滴度（TCID50）病毒（100 μl/孔），孵育2 h，使病毒进入细胞内，用DMEM 液洗去游离病毒，加入稀释的药物样品（5 mg/ml），37℃、5% CO2环境下培养48 h。设立细胞对照、病毒对照和空白对照孔，阳性对照药为奥司他韦，记录细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），按Reed-Muench 法计算能抑制50% CPE 产生的药物有效浓度（EC50）。

治疗模式分别在感染病毒后0、2、4、6、8、10、12 h 加入药物，孵育后，弃去药物，用PBS（phosphate buffer saline）冲洗2 次，加入MEM 培养基，每个时间点设病毒感染对照组。12 h 后，测定各时间点的TCID50。

2.2 体内抗流感药效实验

Balb/c 小鼠随机分为4 组，每组6 只。将病毒尿囊液用病毒稀释液按100、10-1、10-2梯度稀释后对小鼠滴鼻10 μl，对照组小鼠用10 μl 稀释液滴鼻。连续观察14 d，记录各组小鼠的死亡情况，观察小鼠肺组织病理变化。

按照随机数表法随机分为6 组，金莲清热泡腾片组[80 mg/（次·只）、60 mg/（次·只）、40 mg/（次·只）]、阳性药物（奥司他韦）对照组[75 μg/（次·只）]、模型对照组、空白对照组。金莲清热泡腾片组在造模后24 h 给药，3 次/d；阳性药物对照组，1 次/d；模型对照组和空白对照组不做任何处理。每天观察记录小鼠体重、皮毛变化和死亡情况，计算小鼠存活率、生存时间等指标评分。

各组分别于感染后第2、4、6、8 天，随机选取4 只小鼠麻醉后处死，解剖观察肺部病变，取右肺匀浆，离心（12 000 rpm，4℃）5 min 后，收集上清液，CPE 法和MTT 法测定其TCID50。PBS 10 倍稀释后，接种到9 ～11 d 龄鸡胚，48 h 后采集尿囊液，血球凝集（hemagglutination，HA）法检测。

各组小鼠治疗5 d 后，在第6 天脱颈处死，无菌条件下取小鼠肺脏，匀浆，进行蛋白免疫印迹技术（Western Blot，WB）实验，检测肺组织中H1N1 病毒HA 蛋白表达量。

3 结果

3.1 药物细胞毒性及病毒TCID50测定结果

CPE 法和MTT 法检测结果均显示，金莲清热泡腾片浸膏TD50为10 mg/ml、TD0为5 mg/ml。奥司他韦TD50为100 μg/ml、TD0为75 μg/ml。

三个毒株的TCID50均为10-4，即该病毒稀释10-4接种可使50%细胞发生病变。

3.2 预防模式体外抗病毒实验结果（CPE法）

在预防模式中，金莲清热泡腾片高、中、低3 个浓度均能明显抑制甲1 型流感病毒NYMCX-179A株10 TCID50、甲3 型流感病毒NYMCX-327 株10 TCID50、乙型流感病毒株（B/Phuket/3073/2013）100 TCID50引起的细胞病变，金莲清热泡腾片高、中浓度组作用效果均比奥司他韦强。

金莲清热泡腾片抗甲1 型流感病毒的最高稀释滴度为10-1TCID50/ml，抗甲3 型流感病毒的最高稀释滴度为10-2TCID50/ml，抗乙型流感病毒的最高稀释滴度为10-2TCID50/ml，均明显低于奥司他韦3 个流感病毒的滴度10-3TCID50/ml，见表1。

表1 金莲清热泡腾片体外抗病毒实验TCID50检测结果（CPE法）

3.3 不同接种时间体外抗流感病毒实验结果

在接种病毒不同时间后加入药物（5 mg/ml），观察细胞病变情况。分别利用MTT 法和CPE 法测定金莲清热泡腾片作用不同时间的TCID50（表2 ～3），结果显示药物抗甲型流感病毒株作用在病毒感染的全复制周期均有效，主要是在感染6 h 后作用明显，此时OD值明显上升，子病毒量明显下降，但其在病毒感染初期的作用不如奥司他韦。

表2 药物抗甲型流感病毒株不同作用时间点给药作用结果（MTT法）

表3 药物抗甲型流感病毒株不同作用时间点给药作用结果（CPE法）

3.4 体内抗甲型流感病毒实验结果

3.4.1 病毒半数致死量（LD50）检测 按照Reed-Muench 法计算LD50得出结论，该病毒液进行10-1.5稀释后，每只小鼠滴鼻10 μl，可使50%的小鼠致死，见表4。

表4 尿囊液稀释液滴鼻小鼠后小鼠死亡情况（n=6）

3.4.2 各组小鼠体重变化、存活率、生存时间等发病评分 金莲清热泡腾片高、中剂量组和奥司他韦治疗组终末体重无差异，金莲清热泡腾片低剂量组体重高于奥司他韦治疗组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），说明金莲清热泡腾片及奥司他韦治疗H1N1 感染均有一定疗效。H1N1 模型组小鼠在感染病毒后6 ～10 d出现死亡，且感染后第8 天出现死亡高峰，金莲清热泡腾片高、中、低剂量组小鼠均未死亡。见表5。

表5 小鼠体重变化及死亡情况统计（n=8）

3.4.3 各组小鼠肺组织病理切片 与空白对照组相比，H1N1 病毒感染组的动物肺病变在感染后4 ～6 d 最严重，肺部网状结构基本消失，肺泡壁增厚，肺泡上皮损伤、脱落，肺泡间毛细血管严重充血，肺间隔中有大量的炎性细胞浸润。金莲清热泡腾片组在开始治疗后能减轻肺病变，在治疗第2 天虽有较明显的肺病变，但是较模型组明显改善，在治疗第4 ～6 天疗效显著，治疗第6 天接近正常肺，有较为清晰的网状结构。金莲清热泡腾片组治疗过程中，低剂量组有效，但有一定的剂量-效应关系，高剂量组优于中、低剂量组，优于奥司他韦治疗组。见图1。

3.4.4 肺组织中H1N1 病毒的TCID50检测结果 金莲清热泡腾片高、中剂量组的活病毒数量明显低于金莲清热泡腾片低剂量组和奥司他韦治疗组（CPE法）；金莲清热泡腾片高剂量组治疗第2、4、6 天细胞的OD值明显高于奥司他韦治疗组和H1N1 病毒感染组；金莲清热泡腾片高、中剂量组第6 天细胞的OD值明显高于奥司他韦治疗组和H1N1病毒感染组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）（MTT 法），说明金莲清热泡腾片高、中剂量组有明显的抗H1N1 病毒作用，并强于奥司他韦治疗组（表6 ～7）。

表6 肺组织中H1N1TCID50（CPE法）

表7 MTT法检测各组肺组织中H1N1活病毒的含量（OD值）

HA 法结果显示，金莲清热泡腾片治疗组在第4 天，金莲清热泡腾片高、中剂量组血凝价开始降低，在第6 天金莲清热泡腾片高剂量组病毒液的血凝价呈阴性，金莲清热泡腾片低剂量组病毒液的血凝价为1 ∶160，和奥司他韦治疗组的血凝价相同。在第8 天金莲清热泡腾片各治疗组病毒液的血凝价均为阴性，说明金莲清热泡腾片高、中剂量组的抗H1N1 病毒作用高于奥司他韦治疗组。见表8。

表8 肺组织中H1N1病毒的TCID50（HA法）

3.4.6 WB 实验检测肺组织中H1N1 病毒HA 蛋白 H1N1病毒HA 蛋白检测结果见图2 ～3，显示各金莲清热泡腾片剂量组肺组织的HA 蛋白表达量明显低于H1N1 病毒感染组，金莲清热泡腾片高剂量组比金莲清热泡腾片低剂量和奥司他韦治疗组的HA 蛋白表达量减少更为明显，说明金莲清热泡腾片能明显抑制H1N1 病毒在肺组织中的HA 蛋白表达。

图2 WB 检测肺组织中H1N1 病毒蛋白相对丰度比较

图3 WB 检测肺组织中H1N1 病毒蛋白（HA）

4 讨论

流行性感冒作为一种由流感病毒导致的急性呼吸道疾病，其感染性强、传播途径广，各类人群普遍易感染[5]。当前在流感治疗上，抗病毒药物长期使用极易产生耐药性[6]。中药、中成药和中药制剂可以通过多途径、多靶点综合抑制病毒在体内的繁殖，从而达到预防和治疗流感的效果[7-8]。

金莲清热泡腾片作为具有清热解毒、利咽生津等药效的中药制剂，其主要成分为金莲花、大青叶、石膏、知母、地黄、玄参和苦杏仁（炒）[9]，对于流行性感冒具有较好的治疗效果，虽然也有应用于治疗小儿咽峡炎、手足口病、上呼吸道感染等疾病的报道[10-12]，但是由于缺乏综合性的药效循证证据，使其在临床应用上未能充分发挥价值。

本研究利用MDCK 细胞株和三个流感病毒株探究金莲清热泡腾片的体外抗病毒活性，同时还构建了甲型流感病毒株感染BALB/c 小鼠模型以验证金莲清热泡腾片的体内抗病毒活性。结果显示金莲清热泡腾片对于三种病毒株均具有抑制作用，在与传统治疗流感药物奥司他韦的比较中，金莲清热泡腾片对三种病毒株的药效均高于奥司他韦，且金莲清热泡腾片的低剂量药效也与奥司他韦的药效相似。本研究还探究金莲清热泡腾片在不同时间点给药对甲型流感病毒株的作用，结果显示奥司他韦在MDCK 细胞感染病毒初期的药效较好，但是在感染6 h 之后，金莲清热泡腾片的药效开始逐渐强于奥司他韦。此外，在进行三种病毒株TCID50实验时，发现金莲清热泡腾片对于甲1 型病毒、甲3 型病毒和乙型病毒的最高稀释滴度（即子病毒量）并不相同，但是与奥司他韦相比，金莲清热泡腾片的最高稀释滴度均更低。细胞在感染甲1 型病毒染毒后的12 h 内，金莲清热泡腾片不同时间点给药结果显示，甲1 型病毒的子病毒量均低于奥司他韦给药后的量，这也证明金莲清热泡腾片在甲1 型病毒感染后的病毒全复制周期均有抑制作用，尤其在感染后6 h 给药药效最好、病毒的子病毒量下降最为明显。此外，本研究还对金莲清热泡腾片进行了体内药效实验研究，构建的甲型H1N1 流感病毒小鼠模型在染毒后6 ～10 d 出现死亡，而金莲清热泡腾片组小鼠均未出现死亡现象；并且通过观察小鼠肺部病变情况发现，金莲泡腾片组的小鼠在干预治疗第2 天即可减轻肺部组织病变症状，在治疗第6 天已经恢复至接近正常肺，并且金莲泡腾片低、中、高浓度组对于肺部感染情况均有明显治疗效果[13-16]。

本研究通过金莲清热泡腾片体内外治疗流感的药效学实验，证明了金莲清热泡腾片抗病毒的活性，为金莲清热泡腾片的临床应用提供科学依据，为抗流感病毒的中药研发开拓思路。