乳腺癌中KAI1与血管生成拟态的临床意义探讨*

赵云霞 崔芳芹 蔡兆根

蚌埠医学院 1 病理生理学教研室 2 病理学教研室,安徽省蚌埠市 233030

近期Chemical Abstracts正式发表了基于185个国家的癌症统计数据,数据显示乳腺癌是女性发病率最高的癌症(占总病例的11.7%),也是主要的癌症死亡原因(占6.9%),乳腺癌已成为全球头号癌症[1]。肿瘤生长需要氧和营养物质的供应,血管增生是肿瘤生长的关键环节。传统观念认为肿瘤中增生的血管是内皮依赖性血管。近年来的研究颠覆了传统的认知,肿瘤生长所需血液供应并非只来源于有内皮的毛细血管,血管生成拟态(VM)也是肿瘤血液供应的模式之一,各种血管模式在肿瘤生长不同时期可能担负着不同的任务。早期可能以VM为主,随着肿瘤生长,马赛克血管逐渐增加,后期内皮依赖性血管成为肿瘤血液供应的主要方式。认为VM在肿瘤早期的生长、侵袭和转移中可能起了重要作用。KAI1是重要的肿瘤抑制基因,其表达的蛋白为四次跨膜蛋白,能够调控膜分子的信号转导,抑制肿瘤的进展和转移。乳腺癌中KAI1与VM间的关系并不明确。本研究通过对乳腺癌病理标本中KAI1和VM的检测与分析,试图寻找预测乳腺癌生长、浸润、转移及预后的指标。

1 材料和方法

1.1 材料 来源于我院病理教研室(第一附属医院病理科),存档的乳腺癌石蜡标本94例,同时收集20例乳腺良性增生性病变组织作为对照,其中10例为2021年存档标本,84例存档时间为2015和2016年两年,所有病例术前均未行其他治疗,且均有完整临床病理资料及随访资料。随访时间为6～72个月。KAI1鼠抗人单克隆抗体购于abcam,CD34鼠抗人单克隆抗体购于珠海贝索公司,ElivisionTMplus试剂盒及DAB显色试剂盒均购于福州迈新公司。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化。ElivisionTMplus法,石蜡标本4μm切片、烤片、烘干,脱蜡至水。染色操作按照试剂盒说明进行。PBS液代替一抗作为阴性对照,已知阳性片作为阳性对照。

1.2.2 CD34+PAS套染。CD34染色操作同上免疫组化进行,显色后先自来水冲洗;后于0.5%高碘酸溶液中进行氧化,自来水冲洗;然后于雪夫染液(Schiff)中反应,自来水冲洗;返色,细胞核复染,脱水,封片。

1.3 结果判定

1.3.1 KAI1免疫组化结果判定。以膜和胞质出现棕黄色颗粒为阳性表达。本研究采用半定量的方法,染色强度乘以染色范围的数值作为评判标准。两者乘积>3分者为阳性,余为阴性。染色强度判断由浅到深：无着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0分、 1分、2分和3分;染色范围判断由小到大：无阳性细胞、≤10%、11%～50%、51%～75%、>75%则分别记为0分、1分、2分、3分和4分。结果由两位高年资病理医生双盲评定。

1.3.2 VM判定。经CD34+PAS套染判定VM CD34阳性表达为胞膜和胞质出现棕黄色颗粒。由于VM是由肿瘤细胞围绕形成管腔样结构,内壁并无内皮细胞衬覆。因此标记内皮的CD34为阴性,而管腔内壁基底样结构可被PAS染成红色的。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0软件对数据进行处理。KAI1和VM与各临床病理参数间关系采用χ2检验或Fisher精确概率法,Spearman等级相关分析KAI1与VM间的相关性,KAI1和VM阳性组与阴性组生存分析采用Kaplan-Meier法。P<0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌中KAI1的表达 KAI1在乳腺癌组中表达率为30.85%(29/94);对照组中仅有1例未检出,表达率为95.00%(19/20)。乳腺癌中KAI1的表达显著低于对照组,两组比较有统计学差异(P<0.01)。见图1、表1。

图1 KAI1阳性染色

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表1 乳腺癌组织中KAI1表达

2.2 乳腺癌中VM检出及与临床病理参数间的关系 VM由高度恶性肿瘤细胞自身形成,肿瘤细胞围绕排列形成管腔样结构,管道内壁无内皮细胞,PAS染色呈红色基底膜样结构(见图2)。本组病例中有33例检出VM,检出率为39.29%(33/84),对照组均未见VM结构,两组差异有统计学意义(P<0.01)。虽然VM与各临床病理参数间均无相关性(见表2),但随肿瘤增大,VM阳性率逐渐增高,阳性率分别为25.00%、44.64%和50.00%。TNM分期中,Ⅰ、Ⅱ期VM阳性率逐渐增高21.43%和50.00%,但Ⅲ期又明显降低36.00%,与目前对VM的认知是相符的。

表2 乳腺癌组织中KAI1、VM表达与临床病理指标间的关系

2.3 乳腺癌中KAI1的表达及与临床病理参数间的关系 有完整病理参数和随访资料的84例乳腺癌组织中淋巴结转移组KAI1表达率为20.41%(10/49),淋巴结转移阴性组为45.71%(16/35),两组有统计学差异(P<0.05)。肿瘤TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期KAI1表达率分别为64.29%、23.53%及25.00%,Ⅰ期与Ⅱ、Ⅲ期间差异有统计学意义(P<0.05),与其他临床病理指标均无相关性。见表2。

2.4 乳腺癌中KAI1与VM间的关系 VM阳性组KAI1阳性率15.15%(5/33),VM阴性组其阳性率为41.18%(21/51),两组差异有统计学意义。Spearman等级相关分析,KAI1与VM间呈负相关(r=-0.275,P<0.05)。见表3。

表3 乳腺癌组织中KAI1与VM间的关系

2.5 生存分析 Kaplan-Meier法分析KAI1表达和VM检出情况对患者生存时间的影响,发现KAI1蛋白阳性组和阴性组的平均生存时间分别为55.50个月和36.68个月,两组有差异(P<0.05)。VM检出阳性组和未检出组平均生存时间分别为33.39个月和48.81个月,两组差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 KAI1及VM不同状态下乳腺癌患者生存曲线

3 讨论

肿瘤生长依靠血液提供氧和营养物质,因此抗血管生成治疗成为肿瘤治疗的一种方式。针对血管内皮的抗血管生成药物已广泛应用于临床,却表现出局限性和耐药性,此现象说明肿瘤细胞可能存在其他方式获取所需营养物质。VM可能是肿瘤抗血管治疗失败的原因。

VM是近年来由Folberg等[2]定义的一种新的肿瘤血液供应模式。VM的提出是对传统肿瘤血管生成认知的挑战和补充。其不同于传统意义上肿瘤内血管的形成,其发生与肿瘤细胞的重塑有关,即肿瘤细胞的上皮间质转化。肿瘤细胞变形围绕形成类似于血管的管状结构,但腔内无内皮细胞,取而代之的是一薄层的基底膜样结构。而且认为VM是肿瘤早期生长中提供氧和营养物质的重要途径,随着肿瘤不断生长,内皮依赖性血管则会逐渐增加,成为主要血液供应方式。正是由于VM在肿瘤生长的早期出现,且管壁薄,通透性高,所以更有利于癌细胞的早期侵袭和转移。本组病例中近40%有VM检出,且随肿瘤增大,VM检出率有增加趋势;在TNM分期的Ⅱ期中,VM检出率明显增高,数据经统计学处理后未发现有统计学意义,可能由于样本量较少,但这一变化趋势符合当前对VM的认知[3]。Kaplan-Meier生存分析显示,VM阳性病例生存时间显著低于VM阴性者,两组差异有统计学意义。提示VM检出意味着患者预后差,可能与VM形成更有利于肿瘤的侵袭和转移有关。

KAI1是目前公认的广谱抑癌基因,研究表明其可抑制胃癌、食管癌、肠癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤的侵袭和转移[4-7],有望成为抗肿瘤治疗的新靶点。通常认为,KAI1主要通过抑制肿瘤组织中的血管生成[8],从而达到抑制肿瘤的生长和转移。本组病例中近70%的患者KAI1阴性表达,有淋巴结转移组病例其表达率显著降低,且KAI1表达与肿瘤TNM分期相关,此与目前在胃癌及肾癌等肿瘤中[9-10]的研究结果相一致。生存分析发现,KAI1表达阴性组5年生存率显著低于阳性组。此结果提示,KAI1的表达缺失促进乳腺癌的生长和转移,与患者不良预后密切相关。

进一步分析KAI1蛋白表达与VM间的关系发现,KAI1蛋白的表达与VM两者之间呈负相关,KAI1表达阴性组VM阳性率显著增高。由此推测KAI1蛋白表达缺失不仅促进的肿瘤血管的形成,更重要的是在肿瘤早期它可能促进VM形成,使肿瘤获得营养物质,促进乳腺癌的生长和早期转移,导致预后不良。同时KAI1蛋白表达的缺失可能通过调控细胞黏附分子,使细胞与细胞及细胞与细胞外基质间的黏附性降低,细胞更易于脱落,进入管壁薄、通透性强的VM中,实现肿瘤的浸润和远处转移[11]。这将是我们下一步的研究方向。

综上所述,VM是乳腺癌侵袭和转移的关键一环,KAI1可能参与调控VM形成的过程,具体机制将是我们下一步研究的重点内容。希望这一结果能为临床乳腺癌治疗研究提供点滴线索。