急性胰腺炎患者血清miR-25-3p、TLR4水平变化及其临床意义

熊燕 周颖 蒋桂珍

[摘要] 目的 檢测血清微RNA（microRNA，miR）-25-3p，Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表达水平，并讨论两者与急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）患者预后的关系。方法 选取2019年3月至2021年3月丽水市第二人民医院收治的178例AP患者作为AP组，同期体检的健康者100例作为对照组。AP组根据病情分为轻型急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）组（n=95）和重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）组（n=83），根据治疗后3个月预后情况分为生存组（n=148）和死亡组（n=30）。比较miR-25-3p、TLR4在各组患者血清中的表达水平，分析miR-25-3p与TLR4表达水平的相关性，采用多因素Logistic回归分析AP患者预后的影响因素，受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线分析血清miR-25-3p、TLR4预测AP患者预后的价值。结果 AP组血清miR-25-3p表达水平明显低于对照组，TLR4表达水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。SAP组血清miR-25-3p表达水平明显低于MAP组，TLR4表达水平明显高于MAP组，差异均有统计学意义（P<0.05）。AP组miR-25-3p表达水平与TLR4呈负相关（r=-0.731，P<0.001）。生存组的血清miR-25-3p表达水平明显高于死亡组，而TLR4表达水平明显低于死亡组，差异均有统计学意义（P<0.05）。Logistic回归分析显示，脂肪酶、急性生理与慢性健康评分Ⅱ（acute physiological and chronic health evaluation-Ⅱ，APACHE Ⅱ）评分及miR-25-3p为AP患者预后的影响因素。ROC结果显示，血清miR-25-3p、TLR4及联合预测AP预后死亡的曲线下面积为0.844[95%置信区间（confidence interval，CI）：0.784～0.904、0.835（95%CI：0.734～0.936）及0.914（95%CI：0.861～0.967）。结论 AP患者血清miR-25-3p表达水平降低，TLR4表达水平升高，二者均与病情严重程度及预后有关，联合检测其表达水平有助于评估预后。

[关键词] 急性胰腺炎；微RNA-25-3p；Toll样受体4；病情严重程度；预后

[中图分类号] R576      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.08.005

Changes of serum miR-25-3p and TLR4 levels in patients with acute pancreatitis and their clinical significance

XIONG Yan1， ZHOU Ying2， JIANG Guizhen1

1.Department of Laboratory， Lishui Second People's Hospital， Lishui 323000， Zhejiang， China; 2.Department of Laboratory， Lishui people's Hospital， Lishui 323000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To detect the expression levels of serum micro-RNA-25-3p （miR-25-3p） and Toll-like receptor 4 （TLR4）， and to discuss the relationship between the two and the prognosis of patients with acute pancreatitis （AP）. Methods A total of 178 patients with AP admitted to Lishui Second People's Hospital from March 2019 to March 2021 were selected as the AP group， and 100 healthy individuals who were examined during the same period were used as the control group. the AP group was divided into mild acute pancreatitis （MAP） group （n=95） and severe acute pancreatitis （SAP） group （n=83） according to their conditions. and the survival group （n=148） and death group （n=30） according to the prognosis at 3 months after treatment. The expression levels of miR-25-3p and TLR4 in the serum of patients in each group were compared， the correlation between miR-25-3p and TLR4 expression levels was analyzed， and the factors influencing the prognosis of AP patients were analyzed using multi-factor Logistic regression， and the value of serum miR-25-3p and TLR4 in predicting the prognosis of AP patients was analysed using receiver operator characteristic （ROC） curves. Results The expression level of serum miR-25-3p in AP group was significantly lower than that in normal control group， and the expression level of TLR4 was significantly higher than that in normal control group （P<0.05）. The expression level of serum miR-25-3p in the SAP group was significantly lower than that in the MAP group， and the expression level of TLR4 was significantly higher than that in the MAP group （P<0.05）. miR-25-3p was negatively correlated with TLR4 in AP group patients （r=-0.731， P<0.001）. The expression level of miR-25-3p in the survival group was significantly higher than that in the death group， while the level of TLR4 was significantly lower than that in the death group （P<0.05）. Regression analysis showed that lipase， acute physio-logical and chronic health evaluation-Ⅱ （APACHEⅡ） score and miR-25-3p were the prognostic factors of AP patients. The ROC results showed that the areas under the curve of serum miR-25-3p， TLR4 and their combination predicting the prognosis of AP death were 0.844 [95% confidence interval （CI）： 0.784-0.904]， 0.835 （95%CI： 0.734-0.936） and 0.914 （95%CI： 0.861-0.967）. Conclusion The expression level of serum miR-25-3p in patients with acute pancreatitis is decreased， and the expression level of TLR4 is increased， both of which were related to the severity of the disease and prognosis. The combined detection of their expression levels is helpful to evaluate the prognosis.

[Key words] Acute pancreatitis; microRNA-25-3p; Toll-like receptor 4; Severity of illness; Prognosis

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是消化道最常见的由多种原因引起的胰腺炎症性疾病，发病率较高，是胰腺内胰酶由于各种因素被激活后而引发胰腺腺泡细胞损伤、间质水肿、出血的炎性反应[1]。AP的病情复杂多变，病变程度轻重不一，轻型急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）易于治愈，而重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）则危及生命，病死率可达30%[2]。近20年来随着国内外学者的不断探索，AP已经形成了被广泛认可的临床治疗体系。然而，多年来AP患者的預后并没有显著变化。因此，了解AP的发病机制、及早确诊以防止病情迁延加重，是改善这一疾病预后不良的关键。微RNA（microRNAs，miRs）是一类进化上高度保守的单链核苷酸序列，通过结合靶向mRNAs的3'非翻译区，在许多生理和病理过程中发挥重要的调节作用。研究表明，miRNAs的表达水平在疾病检测和严重程度诊断方面有很好的评估价值，且miRNAs被证实在胰腺炎中的表达与正常胰腺有显著差异，如miR-373-5p，miR-374a-5p在胰腺炎中的表达显著下调[3]。miR-25-3p作为miRNAs家族成员之一，通过调控靶标mRNA与炎症反应的进展有关[4]。Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）是Ⅰ型跨膜蛋白，是一类天然免疫受体，在对肠道微生物的免疫耐受中起着关键作用[5]。TLR4是TLR家族中最先发现的成员，位于全身许多不同类型的细胞，已被证明参与多种慢性或急性炎症疾病的发展[6]。miR-25-3p和TLR4均被证实与炎症疾病密切相关，因此，本研究旨在探究血清miR-25-3p和TLR4水平与AP病情及预后的关系。

1  资料与方法

1.1  一般资料

选取2019年3月至2021年3月丽水市第二人民医院收治的178例AP患者作为AP组，同期体检的健康者100例作为对照组。AP组中，男104例，女74例，平均年龄（49.59±6.39）岁。对照组中，男55例，女45例，平均年龄（50.13±5.05）岁。依据AP分级标准[7]将178例AP患者分为轻型急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）组（n=95）和重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）组（n=83）；根据AP患者治疗后3个月预后情况，将其分为生存组（n=148）和死亡组（n=30）。AP患者纳入标准：①符合《中国急性胰腺炎诊治指南》[8]中的诊断标准；②起病急，发病48h内入院；③无胰腺炎疾病史。对照组纳入标准：①无慢性或基础疾病史；②无任何临床症状；③体检结果正常。排除标准：①合并其他急性或慢性炎症；②全身免疫性疾病或凝血功能障碍；③合并呼吸衰竭、肾衰竭等基础疾病；④严重精神疾病；⑤临床信息不全；⑥合并胃溃疡、胆道手术、胃肠肿瘤等消化道疾病。本研究经所有受试者均知情并签署知情同意书，经丽水市第二人民医院医学伦理委员会审批通过（伦理审批号：K2018274）。

1.2  方法

1.2.1  数据收集  收集AP患者年龄、性别、体质量指数（body mass index，BMI）、吸烟史、饮酒史、AP病因及脂肪酶、血钙、白细胞计数（white blood cell count，WBC）、C反应蛋白（C reactive protein，CRP）、空腹血糖（fasting blood sugar，FBG）、急性生理与慢性健康评分Ⅱ（acute physiological and chronic health evaluation-Ⅱ，APACHE Ⅱ）。所有AP患者和对照组均在清晨空腹状态下抽取静脉血5ml，静置25min后离心取血清，装于无RNA酶的EP管中，-80℃保存备用。使用前，将血清于冰上解冻。

1.2.2  血清miR-25-3p相对表达量检测  取0.25ml血清参照Trizol试剂盒（货号：CD-13433-ML，购自武汉纯度生物科技有限公司）的方法提取血清总RNA，并检测RNA的完整度和浓度，合格的RNA采用iScript cDNA反转录试剂盒[货号：1708890，购自Bio-Rad生命医学产品（上海）有限公司]转录得到cDNA，置于-20℃保存，以cDNA为模板，采用qRT-PCR法检测血清miR-25-3p的表达水平，qRT-PCR反应使用SYBR Green Master Mix试剂盒（货号：Code NO. RR420L，购自日本Takara公司）和实时荧光定量PCR仪（型号：ABI7500，购自美国ABI公司）完成。qRT-PCR引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，以U6为内参基因。引物序列（5'-3'）为：miR-25-3p-F：ATTGCACTTGTC TCGCTCTG，miR-25-3p-R：CCAAGCTTTCTCAGAC CGAGACAAGTGC；U6-F：ATTGGAACGATACAG AGAAGATT，U6-R：CGAACGCTTCACGAATTTG。反应体系共20?l：定量预混液10?l，cDNA（<100ng）2?l，上下游引物（10?mol/L）各0.4?l，ROX Reference Dye （50×）0.08?l，ddH2O加至20?l。反应条件：95℃预变性30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环，每个样品设置3个复孔，试验共重复3次。采用2-??Ct法计算相对表达量。

1.2.3  血清TLR4水平检测  采用酶联免疫吸附法检测血清TLR4水平，试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司（货号：KL-TLR4-Hu），检测严格按照试剂盒上的要求操作。

1.3  统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用例数（百分比）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，采用Pearson分析AP患者血清miR-25-3p和TLR4的相关性。采用多因素Logistic回归分析AP患者预后的影响因素，受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线分析血清miR-25-3p和TLR4水平预测AP患者预后的效能，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  对照组和AP组血清miR-25-3p、TLR4表达水平比较

AP组血清miR-25-3p表达水平明显低于对照组，TLR4表达水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2  MAP组和SAP组血清miR-25-3p、TLR4表达水平比较

SAP组血清miR-25-3p表达水平显著低于MAP组，血清TLR4表达水平显著高于MAP组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3  AP组血清miR-25-3p、TLR4表达水平相关性分析

相关性分析显示，AP患者血清miR-25-3p与TLR4呈负相关（r=-0.731，P<0.001），见图1。

2.4  生存组与死亡组一般资料比较

两组间年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、病因、WBC、CRP及FBG水平相比，差异均无统计学意义（P>0.05）。死亡组与生存组的血钙、脂肪酶水平及APACHE Ⅱ评分比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.5  生存组与死亡组血清miR-25-3p、TLR4表达水平比较

生存组miR-25-3p表达水平高于死亡组，TLR4表达水平低于死亡组，差异均有统计学意义（P< 0.05），见表4。

2.6  影响AP患者预后的多因素Logistic回归分析

以死亡为因变量，以单因素分析中差异有统计学意义的血钙、脂肪酶、miR-25-3p、APACHE Ⅱ评分为自变量，将其纳入多因素Logistic回归分析，结果显示脂肪酶、APACHE Ⅱ评分为影响AP患者预后的危险因素，而miR-25-3p为影响预后的保护因素，见表5。

2.7  血清miR-25-3p、TLR4水平预测AP患者预后的ROC曲线分析

结果显示，血清miR-25-3p预测AP预后死

亡的曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.844[95%置信区间（confidence interval，CI）：0.784～0.904]，敏感度为80.00%，特异性为82.40%，截断值为0.51；血清TLR4预测AP患者预后死亡的AUC为0.835（95%CI：0.734～0.936），敏感度为76.70%，特异性为84.50%，截断值为28.55ng/ml。二者联合预测的AUC为0.914（95%CI：0.861～0.967），敏感度为93.30%，特异性为81.80%，见图2。

3  讨论

AP是最常见的炎症性疾病，任何年龄段均可发病。AP的临床治疗主要取决于疾病的严重程度，其中，MAP患者只需要短期住院治疗，但SAP患者往往需要重症监护，因此在疾病进展的早期准确诊断疾病严重程度，以便采取合适的临床治疗措施，对于改善AP患者预后情况至关重要。但迄今为止，还没有单一的指标足以准诊断AP严重程度，有必要开发新的生物标志物，能够可靠地诊断AP患者的严重程度。

miR-25-3p位于13号染色体7q22，据报道其对凋亡、自噬、氧化应激、炎症、钙处理等具有重要调控作用，是常见癌性和非癌性疾病的关键调节剂[7]。有研究发现，miR-25-3p在乳腺癌、食道癌等多种不同类型癌症中表达上调，可促进细胞迁移和侵袭[9-10]。另外有研究表明，miR-25-3p在多种疾病中表达下调。最近的文献证实，miR-25-3p在脓毒症中表达降低，其低表达与败血症的严重程度有关，通过抑制炎症反应可以减少由败血症引发的损伤[11]。Cisilotto等[12]研究显示，急性肝硬化中miR-25-3p表达降低，可能是由全身炎症引起的，其表达降低受肝脏疾病严重程度影响。Liu等[13]研究认为，血清miR-25-3p的表达水平在糖尿病肾病中通常被下调，影响该疾病的严重程度。本研究结果显示，AP组血清miR-25-3p表达水平明显低于对照组，说明miR-25-3p與AP疾病发生发展有关。SAP组的患者血清miR-25-3p表达水平显著低于MAP组，结合以往的研究报道，提示miR-25-3p在AP发病过程中发挥作用，其下调表达与AP的严重程度密切相关。进一步分析miR-25-3p与预后的关系，本研究结果显示，生存组患者miR-25-3p表达水平明显高于死亡组，说明miR-25-3p异常表达参与AP疾病进展。多因素回归分析显示，miR-25-3p是AP患者预后的影响因素，提示miR-25-3p与AP预后密切相关，血清中miR-25-3p表达水平变化可以预测患者预后情况。ROC曲线结果显示，miR-25-3p预测AP预后死亡的AUC为0.844，说明miR-25-3p对于AP疾病预后有一定的预测价值。

越来越多的证据表明miR-25-3p可能与控制炎症反应相关基因表达有关[14]。TLR4是广泛分布于多种细胞内的天然免疫重要炎症分子，通过激活下游的信号通路，诱发炎症反应因子，从而引起炎症反应，且是miR-25-3p的潜在靶点。TLR4的表达与AP的发生、发展及病情的严重程度密切相关，敲除TLR4的小鼠比野生小鼠中的胰腺损伤和炎症反应较轻，且AP的发展与TLR4及其下游的核因子-κB及p-STAT-3信号通路有关，提示TLR4可能通过抑制核因子-κB和p-STAT-3通路缓解SAP的发生与发展[15]。王彬等[16]在SAP组大鼠的研究中发现TLR4在肾脏组织的表达变化与血清促炎细胞因子的变化相一致，表明TLR4在在SAP中发挥促炎作用[17]。本研究结果显示，与对照组相比，AP组的TLR4表达水平显著升高，同时SAP组血清TLR4表达水平显著高于MAP组，进一步证实TLR4参与AP的发生、发展，其表达水平可反映AP的严重程度。本研究结果显示，死亡组TLR4表达水平高于生存组，说明TLR4异常表达参与AP疾病进展，ROC曲线结果提示TLR4的表达水平对于AP预后具有一定的预测价值。有研究表明，miR-25-3p与TLR4靶向结合抑制TLR4以及炎症因子TNF-α、白细胞介素6、白细胞介素β的转录，从而抑制糖尿病肾病的发生发展[18]，本研究结果与其类似，在AP患者中，两者表达水平呈负相关，初步证明miR-25-3p是TLR4重要的调节因子，但具体作用仍需进一步研究。为了提高对AP预后的预测价值，将其miR-25-3p与TLR4联合预测AP预后，结果显示，AUC为0.914（95%CI：0.861～0.967），敏感度为93.30%，特异性为81.80%，预测效能高于单一指标检测，且能够降低漏诊率，提高准确率，从而有利于临床尽早制定治疗方案，改善预后。

综上所述，急性胰腺炎患者血清miR-25-3p表达水平降低，TLR4表达水平升高，二者均与病情严重程度及预后有关，联合检测其表达水平有助于评估预后。

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