丹皮酚多晶型的制备、表征及其体外溶出行为研究

2023-05-25周洪亮高紫薇田明鑫周晓雯

现代中药研究与实践 2023年2期

周洪亮，高紫薇，田明鑫，周晓雯*

（1.南京中医药大学附属医院药学部，江苏南京 210029；2.南京中医药大学第一临床医学院，江苏南京 210046）

丹皮酚是一种天然的酚类化合物，又称芍药醇、牡丹酚，易溶于甲醇或乙醇，溶于热水，不溶于冷水[1]。主要来源于毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosaAndr.、萝摩科植物徐长卿Cynanchum paniculatum(Bge.) Kitag.，具有确切的镇痛[2-3]、抗炎[4]、神经保护[5]等作用。目前已有丹皮酚软膏、丹皮酚片、丹皮酚注射液等剂型上市，主要用于湿疹、皮炎、风湿性关节炎等症的治疗。

虽然丹皮酚具有广泛的药理作用，但因其水溶性差、代谢快、易挥发等特点制约了其临床应用。目前针对上述问题的研究多以化合物结构修饰[6-7]及剂型优化为主，剂型研究中纳米制剂、环糊精包合物、固体分散体、非离子表面活性剂囊泡等均见报道，而固体分散体的制备研究中，谢慧超等[8-9]制备的固体分散体所用的丹皮酚原料的X 射线衍射结果存在较大差异，分析丹皮酚可能存在多晶型现象，但查阅文献未见相关报道。

药物的多晶型是指药物在不同的结晶条件下，药物分子与溶剂分子之间会形成不同的相互作用和结合方式，从而导致药物形成两种或两种以上的晶型。多晶型现象会影响药物的生物利用度、稳定性、溶解度及溶出速率等，晶型研究对药物研发，尤其固体制剂的开发来说至关重要。本研究采用单一溶剂重结晶法制备丹皮酚不同晶型并对其进行表征，通过溶出度试验法比较不同晶型溶出行为差异，为丹皮酚晶型质量控制及固体口服制剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 SDT Q600 型同步热分析仪（美国TA公司）；JSM-6510 型扫描电子显微镜（日本电子株式会社）；D8 Adavance 型X 射线粉末衍射仪（德国布鲁克光谱仪器公司）；Bruker IFS-55 型傅里叶变换红外光谱仪（德国布鲁克光谱仪器公司）；1100 型高效液相色谱仪（G1314A 型紫外检测器，美国安捷伦科技公司）；Sartorius BP-211D 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；ZRS-8G 型智能溶出试验仪（天津天大天发科技有限公司）。

1.1.2 试药丹皮酚（批号：Le0h0521，纯度：99.86%）购于上海皓鸿生物医药科技有限公司；乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、正己烷为分析纯，均购于成都市科隆化学品有限公司；超纯水为实验室自制。

1.2 方法

1.2.1 多晶型样品的制备晶型I：取丹皮酚5 g，加水混悬后80 ℃加热至丹皮酚溶解（融化），保持30 min，置冰水混合物（0 ℃）中不停摇晃使其结晶，抽滤，30 ℃真空干燥；晶型II ～ VI：取丹皮酚各5 g，分别加适量乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、正己烷溶解（必要时适当加热使溶解）后30 ℃真空干燥。

1.2.2 多晶型表征采用X-射线粉末衍射分析法（XRPD）、傅里叶红外光谱法（FT-IR），扫描电镜法（SEM）及热分析法（TA）对制备的6 种晶型样品进行分析表征。

1.2.3 不同晶型丹皮酚在4 种介质中的溶出曲线

取相同粒度（过三号筛）丹皮酚的不同晶型样品40 mg，精密称定，置900 mL 溶出介质中，采用桨法，在37 ℃，转速75 r/min 条件下，分别于5、10、15、20、30、45、60、90、120 min 取样5 mL（各时间点取样完成后补充等温介质5 mL），0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，按2020 年版《中国药典》“牡丹皮”项下[10]丹皮酚含量测定方法进行测定，计算溶出度，并以累积溶出度为纵坐标，时间为横坐标，分别绘制不同晶型丹皮酚在水、盐酸溶液（pH = 1.2）、醋酸盐缓冲液（pH = 4.5）、磷酸盐缓冲液（pH = 6.8）中的溶出曲线。

2 结果与分析

2.1 多晶型表征

2.1.1 X-射线粉末衍射图谱分析对比丹皮酚6种晶型的XRPD 图谱发现，丹皮酚各晶型样品衍射峰主要集中于衍射角（2θ）为10° ～ 30°的区域范围内且12°、25°左右的衍射峰强度均较高，见图1。不同晶型样品的衍射峰位置、数量、强度之间又存在明显差异，晶型I、III、VI 衍射峰数量相对较多，强度较低，而晶型II、IV、V 数量相对较少。各晶型中2θ 为13.8°、26.4 °、12.3°、34.7°、37.2°的衍射峰分别为晶型I、II、IV、V、VI 的特有衍射峰，且强度较高，可作为丹皮酚各晶型区分的特征峰。

图1 丹皮酚不同晶型的XRPD 图谱Fig.1 XRPD spectrograms of different crystal forms of paeonol

2.1.2 热分析图谱分析 SDT-Q600 同步热分析仪具备差示扫描量热分析（DSC）和热重分析（TGA）双重功能。在TGA 曲线中，丹皮酚晶体的失重温度为100 ～ 200 °C，主要为丹皮酚分子的气化所致，这也解释了丹皮酚可以用水蒸气蒸馏法提取的原因。在DSC 曲线中，50 ℃左右的峰为丹皮酚融化所致吸热峰，丹皮酚6 种晶型的熔点分别为59.09、50.91、44.67、51.34、51.42、50.80 °C，其中，晶型II、IV、V、VI 熔点与文献报道的49 ～ 51 °C[11-12]吻合，而晶型I 的熔点为59.09 °C，晶型III 熔点为44.67 °C，与文献报道熔点温度[11-12]有一定差距，分析为晶型差异导致。此外，各晶型样品200 °C 左右还有一个较大的吸热峰，该峰与TGA 曲线的失重温度一致，由丹皮酚在该温度下气化吸热导致。不同晶型丹皮酚样品的DSC 和TGA 分析曲线见图2。

图2 丹皮酚不同晶型的热分析曲线Fig.2 Curves of thermal analysis of different crystal forms of paeonol

2.1.3 傅里叶红外光谱分析傅里叶红外光谱图中1 650 ～ 1 450 cm-1区域出现的芳环骨架伸缩振动以及3 100 ～ 3 000 cm-1的苯环上C—H 伸缩振动可以证明苯环的存在，3 071 cm-1处出现的宽峰为酚羟基的伸缩振动，1 620 cm-1处的吸收峰是芳酮羰基的伸缩振动，因苯环和羰基的共轭作用而出现红移，1 207 cm-1处的强吸收峰为芳香醚中的C—O 的伸缩振动，以上结果表明分子中含有苯环、酚羟基、羰基以及芳香醚等特征基团，与丹皮酚结构相符。不同晶型丹皮酚样品的红外光谱图中晶型I 3 443 cm-1区域无吸收峰、1 914 cm-1处吸收峰明显弱于其它晶型，晶型II、III 1 200 ～ 1 460 cm-1区域峰强度较弱。晶型IV、V 1 914 cm-1区域峰强度相对较弱，晶型VI 3 443 cm-1区域无吸收峰，其它区域的峰强度均弱于其它晶型。红外光谱吸收峰的数量、强度差异反应了不同晶型丹皮酚分子间作用力的差异，这与晶型导致共价键的伸缩振动或弯曲有关，见图3。

图3 丹皮酚不同晶型的红外光谱图Fig.3 FT-IR spectrograms of different crystal forms of paeonol

2.1.4 电镜扫描图像分析不同晶型呈现出了明显的形态差异，晶型I 呈不规则团絮状；晶型II 呈柱状平行排列的纤维状集合体；晶型III 呈鳞片状，晶体薄，表面粗糙；晶型IV、V 较为相似，呈针状，晶型IV表面光滑，比表面积更大，而晶型V较为粗糙；晶型VI 则为不规则块状，见图4。

图4 丹皮酚不同晶型的扫描电镜图Fig.4 SEM images of different crystal forms of paeonol

2.2 不同晶型丹皮酚在4 种介质中的溶出曲线

丹皮酚各晶型样品在水、盐酸溶液（pH = 1.2）、醋酸盐缓冲液（pH = 4.5）、磷酸盐缓冲液（pH = 6.8）中的溶出曲线表明，不同晶型之间的溶出行为具有较大差异，见图5。各晶型中，晶型III 在各介质中溶出均较快，晶型II 次之，晶型I 溶出最慢，晶型IV、V、VI 基本一致，无显著性差异。有研究表明[13]，丹皮酚12 h 平衡溶解度呈pH 依赖性，介质pH 值越低溶解度越高，pH = 2.2 条件下的溶解度是pH = 6.8时溶解度的1.8 倍，而本研究中丹皮酚在4 种介质中的溶出趋势基本一致，未见明显的pH 依赖性，与谢慧超等[8]的研究结果一致。

图5 丹皮酚不同晶型在4 种介质中的溶出曲线（n = 3）Fig.5 Dissolution curves of different crystal forms in 4 dissolution media（n = 3）

3 讨论

多晶型现象在自然界中广泛存在，据统计，50%以上固体药物存在多晶型现象，而临床使用的药物70%为固体口服制剂。不同晶型对药物的稳定性、生物利用度、药效以及安全性等可能产生较大的影响[14]。丹皮酚相关制剂虽已上市应用，但仍面临着水溶性差、易挥发等问题，本研究从晶型研究角度出发，筛选出了具有较高熔点的晶型I 和较快溶出速度的晶型III，对于上述问题的解决具有一定的意义。

晶型研究过程中还发现，丹皮酚常温状态下可呈固、液两种状态。曾尝试将丹皮酚加热融化后置常温条件下进行析晶，但未获成功，液态丹皮酚在无人为干预的情况下可存在数月之久。而丹皮酚熔点为49 ～51 ℃，该状态下丹皮酚为过冷液体，属于不稳定状态（介稳状态），在剧烈摇晃或加入晶体种子后则瞬间转变为固态丹皮酚。丹皮酚晶型制备过程中共尝试了8 种溶剂，其中，乙酸乙酯、乙腈中获得的晶型判断为同一晶型，而甲醇中获得的晶型与初始晶型一致，最终获得了6 种晶型丹皮酚固体。

多晶型药物主要通过溶出速率、吉布斯自由能等影响生物利用度，尤其是药物自身的溶出速率是影响其吸收、分布的关键因素，体外溶出曲线的研究对晶型研究具有重要意义。由于制剂过程中的压力、溶剂、干燥温度等因素可能对晶型有较大影响，因此在溶出曲线测定过程中采用同一粒径的原料进行测定，这样的比较更简单明了，排除了制剂过程中可能存在的晶型转变对溶出曲线的影响。