基于一测多评法的不同产地白术药材质量评价

张国亮，余欢欢，陈栋杰，王汉波，王 瑛,3，徐 靖,4，李明焱,3,4，李振皓,,4*

（1.浙江寿仙谷植物药研究院有限公司，浙江 杭州 311100；2.浙江寿仙谷医药股份有限公司，浙江金华 321200；3.寿仙谷珍稀药材产品省级重点农业企业研究院，浙江 金华 321200；4.浙江省珍稀植物药工程技术研究中心，浙江 金华 321200）

白术为菊科苍术属白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的根茎，具有健脾益气、燥湿利水的功效[1]，主要分布在浙江、安徽、湖南、江西、河北等地[2]。浙江是白术的道地产区，但近年来浙白术出现了品种混乱、产地变迁等情况，影响浙白术的合理应用[3]。

目前，白术的质量标准大多数仅对醇溶性浸出物、挥发油等指标进行了规定，只有《香港中药材标准》对白术内酯Ⅲ的含量进行了规定。白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮是白术中重要的生物活性物质，均能发挥抗肿瘤、抗炎以及抗氧化等药理作用[4-5]，对白术的临床疗效起到了重要的作用。为了更好地评价市场上白术药材的品质，本研究基于一测多评法测定3 个不同产地的白术药材中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的含量，并对挥发油和醇溶性浸出物进行测定，为白术药材的质量评价提供更全面的方法。

1 材料

1.1 药物与试剂

白术内酯Ⅲ（批号：PS010512，纯度：99.50%）、白术内酯Ⅱ（批号：PS010511，纯度：99.38%）、白术内酯Ⅰ（批号：PS010510，纯度：99.97%）、苍术酮（批号：PS011118，纯度：99.76%），以上对照品均购于成都普思生物科技股份有限公司。乙腈（色谱纯，美国Merck 公司），其余试剂均为分析纯。

25 批白术药材分别采购于安徽、河北、浙江3个不同产地，经朱卫东高级农艺师鉴定为菊科苍术属白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的根茎，详细信息见表1。

表1 25 批白术药材编号及产地信息Tab.1 25 batches of Atractylodis macrocephalae rhizome number and origin information

1.2 主要仪器

ACQUITY Arc 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Waters SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Welch Ultimate LP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；XS205 型十万分之一天平［梅特勒-托利多科技（中国）有限公司］；Centrifuge 5430R 型高速冷冻离心机（德国艾本德股份公司）；小型高速离心机（德国艾本德股份公司）；KQ52000E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 一测多评法的建立

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取白术内酯Ⅲ6.30 mg、白术内酯Ⅱ 5.75 mg、白术内酯Ⅰ 5.96 mg和苍术酮15.60 mg，分别置于5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别精密量取各对照品贮备液1 mL，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配成浓度为126.0 μg/mL、115.0 μg/mL、119.2 μg/mL、312.0 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取本品粉末约2.0 g，精密称定。置于50 mL 离心管中，加10 mL 甲醇，静置2 h 后，超声30 min，6 000 r/min 离心20 min（离心半径7.5 cm），取上清液转移至50 mL 容量瓶中，重复提取2 次，合并提取液，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，得供试品溶液，备用。

2.1.3 色谱条件 Waters Sunfire C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A 为乙腈，B 为水，梯度洗脱（0 ～ 5 min，20%A；5 ～ 10 min，20% → 60%A；10 ～ 25 min，60% → 90%A；25 ～ 30 min，90%A；30 ～ 32 min，90% → 100%A；32 ～ 40 min，100%A），柱温：25℃，检测波长：220 nm（白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ和苍术酮）和276 nm（白术内酯Ⅰ）；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL。该条件下，各色谱峰分离度大于1.5，理论塔板数均大于5 000，见图1。

图1 高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatogram

2.1.4 方法学考察 （1）线性关系考察 精密量取“2.1.1”项下混合对照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，注入色谱仪，按“2.1.3”项下色谱条件进行测定。以对照品质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。由表2 可知，白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮在相应的浓度范围内均有良好的线性关系。

表2 线性关系考察结果Tab.2 Results of linear relationship examination

（2）精密度试验 取“2.1.1”项下混合对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6 次，测得结果显示白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的峰面积RSD 分别为0.62%、0.39%、0.87%和0.59%，表明仪器精密度良好。

（3）重复性试验 取同一批白术药材，精密称定6 份，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，“2.1.3”项下色谱条件进行进样分析，结果得样品中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮含量的RSD分别为1.24%、1.56%、0.96%和1.33%，表明该方法重复性良好。

（4）稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 时，按“2.1.3”项下色谱条件进样，结果显示白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮峰面积的RSD分别为1.21%、1.22%、1.84%和0.98%，表明该供试品溶液在24 h 内稳定性较好。

（5）加样回收率试验 精密称取已知含量的白术药材粉末1.0 g，共6 份，精密加入“2.1.1”项下对照品储备液适量，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，“2.1.3”项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果显示白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的平均加样回收率为101.2%、100.8%、99.2%和102.8%，RSD 分别为0.84%、0.87%、0.64%和1.02%，表明该测定方法准确可靠。

（6）样品的含量测定 分别取25 批白术样品适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，“2.1.3”项下色谱条件进行测定，计算样品中4种成分的含量。

2.1.5 相对校正因子的确定 按“2.1.1”项下制备不同浓度的标准品溶液，依法测定峰面积，以白术内酯Ⅲ为内参物，采用多点法计算白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮相对于白术内酯Ⅲ的f白术内酯Ⅱ/白术内酯Ⅲ、f白术内酯Ⅰ/白术内酯Ⅲ、f苍术酮/白术内酯Ⅲ，结果见表3。

表3 多点法计算相对校正因子Tab.3 Multi-point method to calculate relative correction factors

结果显示，采用多点法计算的f白术内酯Ⅱ/白术内酯Ⅲ为0.659，f白术内酯Ⅰ/白术内酯Ⅲ为0.511，f苍术酮/白术内酯Ⅲ为1.54。

2.1.6 耐用性考察 （1）不同色谱柱对相对校正因子的影响 使用XBridge、SunFire以及Ultimate C183 种不同的色谱柱，分别测定并计算f白术内酯Ⅱ/白术内酯Ⅲ、f白术内酯Ⅰ/白术内酯Ⅲ、f苍术酮/白术内酯Ⅲ，结果显示，3 种不同色谱柱的相对校正因子的RSD 均小于2%，表明白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮在不同色谱柱上的耐用性较好，见表4。

表4 不同色谱柱对相对校正因子的影响Tab.4 Effect of different columns on the relative correction factors

（2）不同流速对相对校正因子的影响 采用SunFire 色谱柱，分别测定不同流速下（0.8、1.0、1.2 mL/min）的f白术内酯Ⅱ/白术内酯Ⅲ、f白术内酯Ⅰ/白术内酯Ⅲ、f苍术酮/白术内酯Ⅲ，结果显示，不同流速下的相对校正因子RSD 均小于1%，表明相对校正因子在流速0.8 ～1.2 mL/min 的耐用性较好，见表5。

表5 不同流速对相对校正因子的影响Tab.5 Effect of different flow rates on relative correction factors

（3）不同柱温对相对校正因子的影响 采用SunFire 色谱柱，分别测定不同柱温下（20℃、25℃、30℃）的f白术内酯Ⅱ/白术内酯Ⅲ、f白术内酯Ⅰ/白术内酯Ⅲ、f苍术酮/白术内酯Ⅲ，结果显示，不同柱温下的相对校正因子RSD 均小于1%，表明相对校正因子在柱温20 ～30℃的耐用性较好，见表6。

表6 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.6 Effect of different column temperatures on the relative correction factors

（4）不同进样体积对相对校正因子的影响

采用SunFire 色谱柱，分别测定不同进样体积下（5、7、10μL）的f白术内酯Ⅱ/白术内酯Ⅲ、f白术内酯Ⅰ/白术内酯Ⅲ、f苍术酮/白术内酯Ⅲ，结果显示，不同进样体积下的相对校正因子RSD 均小于2%，表明相对校正因子在进样体积5 ～ 10 μL 下的耐用性较好，见表7。

表7 不同进样体积对相对校正因子的影响Tab.7 Effect of different injection volumes on the relative correction factors

2.1.7 待测成分色谱峰的定位 中药化学成分复杂，色谱图中除了待测成分峰外存在其它色谱峰，因此待测成分色谱峰的准确定位是实现一测多评的前提。考察不同色谱柱对相对保留时间的影响，结果显示，R白术内酯Ⅱ/白术内酯Ⅲ、R白术内酯Ⅰ/白术内酯Ⅲ、R苍术酮/白术内酯Ⅲ的相对保留时间RSD 分别为1.40%、1.42%、3.89%，表明用待测组分与内参物相对保留时值来定位具有可行性，见表8。

表8 待测成分色谱峰的定位Tab.8 Localization of the peaks of the components

2.1.8 样品含量测定及一测多评法的验证 按“2.1.2”项下方法制备25 批不同产地白术的供试品溶液，“2.1.3”项下色谱条件进行分析，使用外标法和一测多评法分别计算各批次样品的含量，并以t检验进行验证一测多评法的准确性，结果见表9。结果表明，一测多评法检测的含量结果较为准确。

表9 外标法与一测多评法的比较（%，n = 2）Tab.9 Comparison of external standard method and QAMS（%，n = 2）

2.2 挥发油和醇溶性浸出物含量测定

参照2020 年版《中国药典》对25 批白术样品中挥发油和醇溶性浸出物进行检测，结果见表10。

表10 25 批不同产地白术样品中挥发油和醇溶性浸出物含量测定结果（%，n = 2）Tab.10 Determination of essential oil and alcohol-soluble extracts in 25 batches of Atractylodis macrocephalae rhizome from different origins（%，n = 2）

表11 白术主要成分之间的相关性分析Tab.11 Correlation analysis between the main components of Atractylodis macrocephalae rhizome

2.3 结果分析

25 批不同产地白术药材中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮含量结果见图2，醇溶性浸出物和挥发油含量结果见图3。结果显示，浙产白术苍术酮含量和挥发油含量明显高于其它2 个产地。

图3 25 批不同产地白术药材中挥发油和醇溶性浸出物含量结果Fig.3 Results of essential oil and alcohol-soluble extracts in 25 batches of Atractylodis macrocephalae rhizome from different origins

2.4 相关性分析

利用SPSS 19.0 作不同成分含量及药材性状间的相关性分析，结果显示，白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ之间存在显著正相关（P＜0.01），苍术酮与挥发油之间也存在显著正相关（P＜0.01）。

3 讨论

一测多评法能显著降低检测成本，具有方便、廉价、稳定的特点，在中药材的质量控制中得到了广泛的应用，如铁皮石斛[6]、黄芩[7]、白芍[8]等。伍蕊嗣等[9]采用高效液相色谱法建立了白术饮片中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的一测多评法，但其检测波长与本实验不一致，白术内酯Ⅰ在220 nm 波长下无吸收。赵玉娇等[10]采用超高效液相色谱法建立了白术药材中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ的一测多评法，但超高效液相色谱仪在大部分实验室中并不普遍，检测成本也相对较高。

因此本实验在前期研究的基础上改善了白术一测多评法，利用白术中主要成分结构的相似性，建立了白术药材中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ和苍术酮的一测多评法，结果显示该方法有效可靠，可为今后白术药材的质量评价提供参考。

中药挥发油多以油滴形态存在于植物表皮的腺毛、油室、油细胞或油管中[11]，本实验在测定25 批不同产地白术药材中的主要成分含量中发现浙江产的白术具有明显优势。通过观察这些产地白术的性状特征发现，浙江产地白术与其他产地相比具有明显的油室，进一步检测其醇溶性浸出物和挥发油含量，发现其苍术酮含量与挥发油具有较好的相关性，这是因为苍术酮为挥发油的主要成分[12]。有研究表明白术挥发油对肿瘤细胞的活性具有明显的抑制作用[13]，并对急性肝损伤具有缓解作用[14]。苍术酮可抑制结直肠癌HT29 细胞的增殖并能介导凋亡[15]，对急性肺损伤也具有保护作用[16]。因此，不同产地造成的化学成分差异可能会影响其药效作用，值得进一步结合药效试验进行评价。

4 结论

本研究测定了25 批不同产地白术药材中白术内酯Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ和苍术酮以及挥发油和醇溶性浸出物的含量，并将含量结果进行数据可视化分析，结果表明浙江产地的白术药材中苍术酮和挥发油含量相比较其他产地具有明显优势，提示苍术酮和挥发油可作为浙产白术的道地性标志物，为今后建立浙产白术的质量标准提供依据。