不同浓度激素配比对防风愈伤组织诱导及再分化的影响

袁梦瑶　张东向　赵越　李婷

摘要 以防风的有活力的种子为材料，通过栽种土培苗，比较不同来源外植体愈伤组织的形成能力，并通过不同激素配比调整，研究愈伤组织分化生根、生芽的适宜条件，进而建立防风组培苗再生体系。结果表明，以幼叶为外植体所诱导出的愈伤组织分化情况最佳，最佳诱导培养基为MS+1.5 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA，诱导率达86.6%；最佳继代培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA，增殖倍数为3.2；最佳诱导丛生芽培养基为MS+0.3 mg/L 6-BA，生芽率为100%；最佳诱导不定根最佳培养基为MS+0.2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IAA，生根率为46.8%。

关键词防风；组织培养；愈伤组织；丛生芽；不定根

中图分类号S567.23+9文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）08-0178-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.041开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Different Concentration Hormone Ratios on Callus Induction and Redifferentiation of Saposhnikovia divaricata

YUAN Mengyao，ZHANG Dongxiang，ZHAO Yue et al（College of Life Sciences and Agriculture and Forestry，Qiqihar University/Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas，Qiqihar，Heilongjiang 161006）

AbstractUsing the active seeds of Saposhnikovia divaricata as materials，the ability of callus formation from explants from different sources was compared by planting soil culture seedlings，and through adjusting the ratio of different hormones，the suitable conditions for callus differentiation，rooting and budding were studied，and then the regeneration system of Saposhnikovia divaricata tissue culture seedlings was established.The results showed that the callus differentiation induced from young leaves was the best，and the optimal induction medium was MS+1.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，with an induction rate of 86.6%.The optimal subculture medium was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA，the proliferation rate was 3.2.The optimal medium for inducing clustered buds was MS+0.3 mg/L 6-BA，and the budding rate was 100%;The optimal medium for inducing adventitious roots was MS+0.2 mg/L 6-BA+0.4 mg/LIAA，and the rooting rate was 46.8%.

Key wordsSaposhnikovia divaricata;Tissue culture;Callus;Clustered buds;Adventitious root

防風［Saposhnikovia divaricata（Trucz.） Schischk.］属伞形科（Umbelliferae）植物［1］，又名山芹菜、川防风、屏风等［2］，产于黑龙江、吉林、内蒙古等省区，以未抽蘖的干燥根入药；主要成分包括多糖类、挥发油、蔗糖、原酮类、挥发油、香豆素类等化合物［3］，具有解热镇痛、镇静、抗菌、抗过敏、抗肿瘤、抗凝血的作用，可以提高机体免疫力。近年来由于随着国内外市场对野生防风需求量的不断增加，野生资源已经不能满足市场需求，采用植物组织培养技术进行防风愈伤组织诱导培养及再分化体系的建立研究，对于防风优良无性系的快速繁殖具有重要意义。

中药材是我国中医药产业赖以生存和可持续发展的基础，随着人类医药事业快速发展，对药用植物的需求量逐年上升，导致药用植物资源日渐匮乏［4］。该试验采用植物组织培养技术，研究不同激素配比对防风愈伤组织诱导增殖及再分化形成不定根和丛生芽的影响，以期为防风快繁体系的建立和中草药栽培提供技术支撑。

1材料与方法

1.1试验材料防风种子由齐齐哈尔市中北药材农民专业合作社提供，经专家鉴定为防风［Saposhnikovia divaricate （Turcz.） Schisck.］的干燥成熟种子，保存于4 ℃冰箱中。

1.2幼苗的培养

1.2.1实生苗培养。选取当年采收成熟且饱满干燥的防风种子，先在蒸馏水中浸泡24 h后，然后播种于实验室内事先盛满土的花盆中，待植株高3～4 cm时待用。

1.2.2无菌苗培养。取一定量的防风种子，先在无菌水中浸泡12 h，注意无菌水始温50 ℃（时间5 min）。在超净工作台内进行无菌操作，先用75%乙醇浸泡1～2  min后，进行初消毒；然后倒去乙醇，转移至0.1%HgCl溶液中浸泡8  min（其间要不停摇动），进行复消毒；最后倒去HgCl溶液，用无菌水反复冲洗5～7次，用滤纸吸取多余水分，之后将其转入MS培养基，使之进行无菌苗培养，当苗 3～4 cm高时备用。

1.3防风愈伤组织的诱导 取防风实生苗植株，经表面消毒处理，将幼茎和幼根切成约1 cm长，叶片切成0.5 m2大小，接种到诱导愈伤组织的培养基上。采用MS培养基，添加0.8%琼脂、3%蔗糖及各种激素，pH 5.8～5.9，在121 ℃高压灭菌30 min。培养条件分为光暗交替（2 000 lx，8 h黑暗/16 h光照），培养温度为（25±1） ℃。每瓶接种5块，每种处理重复8次，培养30 d后统计愈伤组织形成情况。

愈伤组织诱导率=长出愈伤组织的外植体块数/接种的外植体块数×100%

1.4防风愈伤组织的增殖培养将生长良好的愈伤组织切成0.5 g的小块，转接到含有不同激素配比的继代培养基上继代培养，研究不同NAA、6-BA和2，4-D配比对愈伤组织增殖状况的影响，共设置7组处理。培养条件分为光暗交替（2 000 lx，8 h黑暗/16 h光照），培养温度为（25±1）℃。每瓶接种3块，每种处理重复8次，30 d后记录愈伤组织长势、颜色和状态，并计算增殖倍数。

增殖倍数=（愈伤组织继代培养后的鲜重－愈伤组织继代培养前的鲜重）/愈伤组织继代培养前的鲜重

1.5防风愈伤组织诱导丛生芽将继代培养中生长旺盛的愈伤组织切成0.5 g的小块，转接到含有不同激素配比的诱导丛生芽MS培养基上，分析6-BA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L）、KT（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L）对愈伤组织诱导丛生芽分化的影响，共设置10组处理。培养条件分为光暗交替（2 000 lx，8 h黑暗/16 h光照），培养温度为（25±1）℃。每瓶接种4块，每种处理重复8次，30 d后统计丛生芽生长情况，并计算丛生芽生芽率。

丛生芽生芽率=生芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织数×100%

1.6防风愈伤组织诱导不定根将继代培养中生长旺盛的愈伤组织切成0.5 g的小块，转接到含有不同激素配比的不定根分化MS培养基上，分别研究不同浓度NAA、6-BA与IAA组合对愈伤组织不定根形成的影响，分别设置5和15组处理。培养条件分为光暗交替（2 000 lx，8 h黑暗/16 h光照），培养温度为（25±1）℃。每瓶接种3块，每种处理重复8次，30 d后统计根数，测量根长，并计算不定根生根率。

不定根生根率=长出不定根的愈伤组织数/接种的愈伤组织数×100%

1.7数据处理采用Excel 2010对试验结果进行统计学分析。

2结果与分析

2.1不同萌发途径对防风种子发芽率的影响分别比较实生栽培途径和无菌培养操作下种子的萌发情况，结果发现（表1），防风种子总体萌发率不高；相比之下实生苗的萌发情况较好，发芽率达20.80%；而无菌苗仅萌发1株，发芽率为0.40%。出现这种情况的原因一方面可能是由于防风种子中抑制物质的存在［5］，另一方面可能是无菌培养过程中表面消毒处理时间过长，影响到种子活力，导致种子发芽率下降。因此在后续工作中，都是以实生苗为外植体材料。

2.2不同激素组合对防风幼叶、幼茎诱导愈伤组织形成的影响为筛选出最适宜后续分化培养的愈伤组织，该研究分别采用了防风的幼根、幼茎、幼叶作为外植体进行愈伤组织诱导，结果见表2。从表2可以看出，幼叶作为外植体诱导的愈伤组织的诱导率最高，最佳激素组合为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，诱导的愈伤组织生长状态良好，呈淡黄色致密松散状，所得愈伤组织出愈时间短，数量多且质量好，后续分化能力强，是比较理想的外植体。其次是幼茎作为外植体诱导愈伤组织效果较好，虽愈伤组织生长状态致密，颜色呈淡黄色，但诱导率没有幼叶诱导率高。在试验中幼根未能诱导出愈伤组织。

2.3不同激素组合对防风愈伤组织增殖培养的影响为促进防风愈伤组织的增殖，该研究分别用 2，4-D、NAA、6-BA组合，比较愈伤组织长势和增殖倍数，结果见表3。从表3可以看出，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA是诱导愈伤组织增殖最适宜的生长素组合，此时的愈伤组织呈淡黄色、疏松颗粒状，整体长势最好，增殖倍数高达3.2，而2，4-D对愈伤组织增殖作用不明显。但当NAA浓度增大时，愈伤组织的增殖有所降低。

2.4不同浓度6-BA对防风愈伤组织丛生芽形成的影响不同浓度的6-BA均可以诱导出丛生芽的生成，经方差分析0.3 mg/L 6-BA對丛生芽的诱导影响显著。从表4可以看出，在光暗交替下，0.3 mg/L 6-BA的生芽率最高，达100%，多数愈伤组织生长状态良好、能够诱导的丛生芽数量多，且分化的丛生芽强壮、芽长；当6-BA浓度为0.5 mg/L时，虽然有不定芽形成，但愈伤组织生长存在褐化现象，诱导的丛生芽瘦弱、矮、数量少，丛生芽生芽率仅为43.75%。在6-BA浓度为0.1～0.3  mg/L时，丛生芽生芽率与生长状态呈递增趋势；当6-BA浓度大于0.3  mg/L时，丛生芽的生芽率逐渐递减。由于 6-BA 在适宜的浓度具有促进细胞分裂和伸长、促进细胞分化及物质的合成和运输、影响细胞中各种酶的活性等作用［5］，如果浓度过低，容易形成多核体阻止细胞分化，加速细胞衰老，逐渐死亡;而高浓度的6-BA 使细胞体积因强烈的分裂活动而急剧缩小，已形成的愈伤组织不能正常生长，逐渐变褐［6］。

2.5不同浓度KT对防风愈伤组织丛生芽形成的影响从表5可以看出，不同浓度的KT对防风愈伤组织丛生芽的诱导效果并不明显，在光暗交替下，在不同浓度的KT诱导下，生芽率最高为75.0%，最低为65.6%。在MS+0.1 mg/L KT的培养基中，愈伤组织诱导的丛生芽数量多、芽长，随着KT浓度的增加，芽的诱导率未有明显的变化，但愈伤组织生长状态出现褐化，且丛生芽数量也在逐渐减少，说明高浓度的KT不适于诱导防风丛生芽。

2.6不同激素组合对防风愈伤组织不定根形成的影响

2.6.1不同浓度的IAA与NAA组合对防风愈伤组织不定根形成的影响。从表6可以看出，不同浓度的 IAA 和NAA对诱导防风不定根的形成促进效果不明显。将愈伤组织接种到不同激素组合的愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织的不定根生根率和生长差异很大。在光暗交替环境下，处理②不定根生根率最大，为50.0%，平均根长为4.6 cm；处理①次之，生根率为37.5%，平均根长为3.4cm；处理④生根率最低，为12.5%，平均根长为2.5 cm，此组处理中生根率比较低，多为须根。

2.6.2不同浓度的6-BA和IAA组合对防风愈伤组织不定根形成的影响。从表7可以看出，在单独添加IAA的处理中，含有低浓度的IAA的培养基上有不定根的生成，而高浓度的IAA没有诱导出不定根。而以0.2  mg/L 6-BA为基础，添加不同浓度的IAA时，愈伤组织的生根率随着IAA浓度的增加呈现先下降再上升的循环变化趋势。

处理⑨愈伤组织的生根率最高，为46.8%，平均根长为2.7 cm，根形多数粗壮，而生芽率为53.3%；其次是处理，生根率较高，为41.6%，平均根长为3.2 cm，多数根形较粗壮，生芽率为50.0%；处理④和处理⑤没有成功诱导出不定根，但有不定芽的形成，生芽率分别为40.6%和40.0%。处理即MS+0.5  mg/L 6-BA +1.0  mg/L IAA，不定芽的诱导率为100.0%，但愈伤组织的生根率仅为16.7%，平均根长为1.8 cm，说明使用不同浓度的生长素和细胞分裂素诱导的结果也不尽相同。

3讨论

利用防风的幼茎能诱导出愈伤组织，幼叶的诱导率高且愈伤组织生长情况优于幼茎的愈伤组织。愈伤组织从结构、生长速度、生长状态都可以分成不同类型，它的生理特性由组成它的细胞类型决定［6］，根据不同的试验目的，需要诱导不同的愈伤组织，该试验所需的愈伤组织结构质地松散，这类愈伤组织由从里到外相同且分散的多细胞形成，这类细胞彼此分开，分裂能力强、细胞质浓度大，适于建立防风的再分化体系［7］。

该试验中，运用了激素及其不同的组合来诱导防风的愈伤组织，其中生长素和细胞分类素是已知的2种重要的调控细胞生长和分化的植物激素［8-9］。张家菁等［10］研究表明不同激素组合对愈伤组织的形成影响很大，生长素2，4- D是愈伤组织形成所必不可少的 ，故在外植体诱导愈伤组织的过程中，每组合均添加了不同浓度的2，4-D。在诱导防风愈伤组织分化的过程中发现，6-BA对愈傷组织的诱导效果好，尤以0.3  mg/L的6-BA诱导的愈伤组织生长状态良好，呈疏松颗粒状，且再分化的丛生芽数量多、芽长，对比其他组合及浓度具有明显优势，但并不是浓度越高诱导效果越好，高浓度的6-BA对愈伤组织分化起抑制作用。

4结论

（1）就外植体而言，以幼叶为外植体所诱导出的愈伤组织分化情况最佳，最高诱导率为86.6%。

（2）在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA培养基上，防风愈伤组织增殖倍数高，为3.2，愈伤组织生长速度快且质地疏松，生长状态良好。

（3）在MS+0.3 mg/L 6-BA培养基上，防风丛生芽的诱导率达到最高，生芽率达到100.0%，芽数多且芽长，分化程度高。

（4）最佳诱导不定根培养基为MS+0.4  mg/L IAA+0.2 mg/L 6-BA，生根条数多且相对粗壮，生根率为46.8%，平均根长为2.7 cm。

参考文献

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［10］ 张家菁，张美珍，于元杰.防风愈伤组织诱导及植株再生体系研究［J］.山东农业科学，2012，44（8）：13-16.