姜酮对急性心肌梗死大鼠心肌的保护作用及机制研究

张帆,刘江文,唐艳红,黄从新

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是全球心血管疾病中致死率最高的疾病之一,主要是由于冠状动脉闭塞或冠状静脉痉挛导致心肌细胞急性缺血缺氧,从而导致心肌细胞坏死[1]。一般将心肌梗死分为3个阶段:炎性反应期、修复期及重塑期[2]。在炎性反应期,过强的炎性反应会波及残存的心肌细胞进一步加剧心肌组织的坏死[3]。Marinkovic等[4]通过S100A9抑制心肌梗死早期炎性反应可明显逆转心功能的衰竭。因此,早期采取抗炎措施能减少心肌组织的丢失,加快心脏的修复及重塑,缓解心肌梗死后心力衰竭的发生[5]。姜除了作为常见的天然香料以外,还可用于治疗多种疾病。姜的药理活性主要归功于姜中的生物活性成分——姜酮,其具有抗氧化、抗炎及抗菌等多种药理学特性[6]。Hsiang 等[7]通过活体小鼠发光证实姜酮可显著抑制脂多糖诱导的核因子κB(NF-κB)上调来发挥抗炎作用。除此之外,Ahmad等[8]发现姜酮通过增加还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性实现对氧化应激的抑制。但姜酮在心血管领域药用作用研究较少,本文就姜酮在急性心肌梗死大鼠模型中的作用及机制展开研究,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物:雄性SPF级SD大鼠,体质量(180±20)g,由武汉大学实验动物中心提供。饲养温度为22℃～25℃,适应性饲养1周后开始实验。试剂:姜酮(ZGR)购自上海融禾医药科技发展有限公司;白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、RIPA裂解液、BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;SOD、丙二醛(MDA)试剂盒购自武汉赛培生物科技有限公司;核转录因子红系2相关因子(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)、NF-κB一抗购自美国Cell Signaling公司。仪器设备:VINNO V6小动物超声仪购自飞依诺科技股份有限公司;凝胶成像系统购自美国Bio-Rad Laboratories公司。

1.2 实验方法 2022年7—9月于武汉大学人民医院心血管病研究所进行实验。将30只大鼠通过随机数字表法分为Sham组、心肌梗死(MI)组、MI+ZGR组,每组10只。MI+ZGR组给予ZGR(6 mg·kg-1·d-1)[9]灌胃预处理14 d后造模,其余2组等量生理盐水灌胃。MI组、MI+ZGR组模型制备:于大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(1 ml/kg)麻醉,备皮后将大鼠仰卧固定于手术台,连接小动物呼吸机辅助呼吸(70次/min)。予以碘伏消毒后于大鼠胸骨左缘1 cm处剪开皮肤,分离肌肉,于第3、4 肋间钝性开胸,充分暴露心脏后,在左心耳下缘约2 mm处用6-0眼科带线缝合针结扎左冠状动脉前降支,心尖部变白提示AMI造模成功。随后挤出胸腔空气,依次缝合肋间、肌肉和皮肤。待大鼠恢复自主呼吸后撤除呼吸机。Sham组施行相同的操作步骤但不结扎动脉。ZGR组术后继续给药1周,Sham组、MI组给予等量生理盐水处理。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 超声心动图检查:造模成功的第7天,使用小动物超声仪将探头置于大鼠左心室乳头肌平面检测大鼠心脏结构和功能。测量指标:左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室短轴缩短率(LVFS)和左心室射血分数(LVEF)。其测量结果取5个心动周期中的平均测量值。

1.3.2 组织病理学检查:于大鼠腹腔内注射3%戊巴比妥钠,麻醉完成后固定于手术台后开胸。使用真空采血管于腹主动脉取血1 ml,迅速剪取心脏并分离保存于4%多聚甲醛中固定。进行包埋、切片、脱蜡、脱水、冲洗,使用苏木素—伊红(HE)染色。通过显微镜观察组织的病理变化。

1.3.3 ELISA法检测血清IL-6、TNF-α及心肌组织SOD、MDA水平:将此前采集的血样于室温存放60 min,使用离心机离心获取血清。取大鼠心肌组织,使用研磨仪研磨成匀浆。按照试剂盒说明书操作流程分别检测血清炎性因子IL-6、TNF-α表达水平及心肌SOD、MDA水平。

1.3.4 Western-blot检测大鼠心肌组织HO-1、Nrf2、NF-κB蛋白的表达水平:取大鼠心肌梗死周边组织,加RIPA裂解液,置于研磨仪中裂解。离心后取上清提取总蛋白,使用BCA试剂盒进行蛋白浓度定量。随后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,电泳结束后对蛋白进行转膜、封闭。与Nrf2、HO-1、NF-κB一抗在4℃下孵育过夜,再与二抗孵育1 h。孵育完成后通过ECL试剂进行显影,使用扫描仪进行条带扫描,Image J软件用于条带的分析。

2 结 果

2.1 3组大鼠超声心动图结果比较 心脏超声检查结果显示,与Sham组比较,MI组大鼠的LVEDD、LVESD均显著增大(P<0.01),LVEF、LVFS显著降低(P<0.01)。而与MI组比较,MI+ZGR组大鼠的LVEDD、LVESD降低(P<0.05或P<0.01),LVEF、LVFS升高(P<0.05),见表1。

2.2 各组大鼠心肌组织病理改变比较 病理学结果显示,Sham组大鼠心肌细胞形态规则,结构正常,未见炎性细胞浸润。而MI组大鼠视野可见明显炎性细胞浸润,间质水肿及心肌细胞坏死。与MI组比较,ZGR处理可以显著减轻AMI大鼠炎性细胞的浸润,改善细胞肿胀程度,见图1。

2.3 ZGR对AMI大鼠血清IL-6、TNF-α及心肌组织SOD、MDA的影响 与Sham组比较,MI组大鼠血清IL-6、TNF-α显著上调(P<0.01),心肌组织中的SOD显著下降(P<0.01),MDA显著上升(P<0.01)。与MI组比较,MI+ZGR组大鼠血清IL-6、TNF-α显著降低(P<0.01),心肌组织SOD显著上调(P<0.01),MDA显著下降(P<0.01),见表2。

表1 各组大鼠超声心动图指标比较

图1 ZGR对AMI大鼠心肌组织病理变化的影响(HE染色,×200)

表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α及心肌组织SOD、MDA表达比较

注:与Sham组比较,aP<0.01;与MI组比较,bP<0.01。

2.4 ZGR对AMI大鼠心肌组织Nrf2、HO-1及NF-κB蛋白表达的影响 与Sham组比较,MI组大鼠的心肌组织中Nrf2、HO-1蛋白表达显著降低,NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与MI组比较,MI+ZGR组大鼠心肌组织中Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著上调,NF-κB蛋白水平显著降低(P<0.01),见图2。

3 讨 论

心肌梗死诱发的心脏损伤可导致无菌性炎性反应,成纤维细胞首先受到缺血和缺氧的影响,其通过上调TLR-NF-κB途径促进pro-IL-1β的转录及翻译[10],激活NLRP3炎性小体后切割pro-IL-1β活化IL-1β,最终释放IL-1β[11]。IL-1β在心肌梗死的炎性反应中发挥关键作用,其可诱导最初的促炎反应和细胞因子/趋化因子的释放,并招募和激活炎性细胞[12]。

在心肌线粒体和内质网的能量代谢过程中会产生活性氧(reactive oxygen species, ROS),通常情况下活性氧的产生与清除处于动态平衡之中[13]。在生理状态下,其对调节心脏发育、收缩及能量代谢均有着重要意义[14]。然而在缺血、缺氧等病理状态下,活性氧水平异常升高会使心肌进入氧化应激状态。大量活性氧的堆积会损伤DNA、蛋白质及脂质,同时引起线粒体的损伤,导致心肌功能异常及心肌细胞死亡。这一过程常见于心力衰竭及心肌缺血等病理状态中。氧化应激同样对IL-1β的激活起到了重要作用[15]。在心肌梗死发生之后,巨噬细胞中线粒体的活性氧积累显著增加,导致促炎细胞因子IL-1β的大量表达[16]。而心肌梗死后炎性反应的加重、延长或扩大会导致心肌梗死后更严重的心肌重塑和功能障碍[17-18]。通过适当的抗炎治疗可减少心肌纤维化并改善心脏重塑[19]。

姜酮是一种天然提取的生物活性物质,姜酮已被证实可激活AMPK/Nrf2/HO-1缓解哮喘中的炎性反应[6,20]。在肺纤维化中,姜酮也展现出强大的抗氧化应激及抗炎性反应作用[21]。Zhu等[22]的研究显示,姜酮可以通过诱导活化Nrf2,使得中性粒细胞中的活性氧水平下降。既往研究表明,Nrf2的激活能显著改善心肌梗死的炎性反应及氧化应激水平[23]。因此,认为姜酮可通过改变Nrf2、NF-κB发挥抗炎及抗氧化应激作用。在本次研究中,发现姜酮可显著改善心功能,并且减少炎性细胞在心肌组织中的浸润。通过检测各组大鼠血清指标,姜酮可显著减轻血清中炎性指标及心肌组织中氧化应激的水平,并上调抗氧化应激分子水平。

NF-κB是关键的细胞内信号分子,在心肌梗死的状态下,存在众多信号通路使其活化,从而驱动TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18等促炎基因的表达[24],同时通过内质网应激介导的机制诱导细胞凋亡。NF-κB的持续活化会加剧心脏重塑,而在缺血—再灌注期间抑制NF-κB的表达有助于减轻心肌炎性反应,减小梗死面积[25]。Nrf2是一种转录因子,它可以通过调节一系列抗氧化酶和抗炎因子的基因表达来减轻细胞损伤,如促进HO-1的表达。HO-1具有酶活性,可以降解血红素并产生低浓度一氧化碳。少量的一氧化碳可以促进线粒体的合成[26]。通过人为诱导Nrf2的表达有助于在缺血条件下减少心肌梗死的面积,保护左心室功能及减少心律失常等不良事件的发生[27]。在本研究中,通过蛋白免疫印迹技术,发现姜酮能通过降低NF-κB水平、激活Nrf2/HO-1的表达来发挥抗炎、抗氧化应激作用。心脏超声及心肌组织病理也证实,其可以改善心肌梗死大鼠的心脏功能状态。

综上所述,姜酮可通过抑制炎性反应及氧化应激反应来保护心肌梗死后的心功能,但是其作用的详细机制及临床应用需要进一步的研究去验证。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

张帆:设计研究方案,实施研究过程,分析实验数据,论文撰写;刘江文:提出研究思路,资料搜集整理,论文修改;唐艳红:论文审核;黄从新:课题设计,论文审核