血管紧张素转换酶2 (ACE2)基因在家猫不同组织中的表达差异分析*

昂艳芬，汪娅媛，严 涵，田仰清，张学峰，严玉霖

(云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650201)

肾素—血管紧张素系统 (renin-angiotensin system，RAS) 是一个复杂的内分泌系统，由多种酶、生物活性肽以及受体组成[1]，在维持血压、电解质及体液稳态方面发挥重要作用，并影响许多器官的功能，如心脏、血管和肾脏等[2]。其中，血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2，ACE2) 是第1 个被人类认知的人血管紧张素转化酶的同源物，对心血管系统有调控功能[3]。而ACE2 也是严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2) 的功能性受体，在SARS-CoV-2 的感染机制中起关键作用[4]。

有研究以家猫心脏、肝脏、肺脏、肾脏和脾脏的总RNA 为模板检测ACE2的表达，结果发现：ACE2仅在心脏、肝脏、肺脏和肾脏中表达[5]。近期研究也表明：ACE2在猫的胃肠道黏膜中广泛表达，胃黏膜上皮细胞和肠神经元均具有ACE2免疫反应性[6]。因此，有学者研究了野生动物、家畜和宠物的ACE2，筛选出猫ACE2利用与人类ACE2相似的结合模式与SARS-CoV-2 RBD相互作用[7]。此外，猫在试验条件下可将 SARSCoV-2 传播给其他猫，表明猫可以感染SARSCoV-2[8]。已有研究从确诊的猫拭子样本中获得SARS-CoV-2 的全基因组序列，经过序列比对其与同期该地区人类样本中的优势株相同[9]。这些证据均提示猫可能是SARS-CoV-2 传播的中间宿主之一，并存在人猫传播的可能性。因此，研究家猫ACE2基因在主要组织的表达分布情况，可为后续进一步深入了解与ACE2相关疾病的致病机制提供理论依据，以期为相关疫情的防控及公共卫生安全提供基础和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究对象为1～2 岁中华田园健康猫6 只 (雌雄各半)，解剖后取其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胰腺和肠系膜淋巴结等8 个组织，置于密封袋后投入液氮中急冻，之后转移至-80 ℃冰箱保存，用于提取组织总RNA。动物实验符合云南农业大学生命科学伦理审查要求。

1.2 引物的设计与合成

在NCBI 中查找家猫ACE2的基因序列 (登录号：NM_001039456) 和内参基因GADPH的基因序列 (登录号：NM_001009307)，利用 DNAstar、Primer 6.0 和 Oligo 7.0等软件设计ACE2和GADPH基因的荧光定量PCR 引物(表1)。

表1 荧光定量的引物序列Tab.1 Primer sequences of fluorescent quantitative PCR

1.3 RNA 的提取与反转录

用TRIzol 法提取各组织总RNA，将完整性良好的RNA 模板进行反转录。按照反转录试剂盒说明书，配置如下20 μL 的体系：Reaction solution from Step 1 10 μL、5×PrimeScript Buffer 2(For Real Time) 4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix 1 1 μL、RT Prime Mix 1 μL、RNase Free ddH2O 4 μL。所得cDNA 置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.4 荧光定量PCR 检测基因mRNA 表达水平

以GAPDH为内参，利用反转录产物进行荧光定量PCR 试验检测ACE2基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胰腺和肠系膜淋巴结中的mRNA 相对表达量，反应体系于八连管中配置，并将八连管转移至荧光定量PCR 仪后运用CFX ConnectTMReal-Time System 系统进行试验。20.0 μL 的 荧光定量 PCR 体系包括：TB Green Premix ExTaqⅡ (Tli RNaseH Plus) (2×) 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，DNA 模板2.0 μL，用灭菌水补足体系。仪器反应程序为：5 ℃ 3 min；95 ℃1 min，50～60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，扩增 40 个循环。每个样本重复检测 3 次，以肺脏作为对照，根据组织的 Ct 值，采用 2-ΔΔCt法计算各组ACE2mRNA 相对表达水平。

1.5 免疫组织化学检测ACE2 蛋白的组织学定位

将肾脏、小肠和胰腺组织用4%多聚甲醛固定，之后设置阴性对照组(一抗用PBS 代替)和试验组，用免疫组织化学法检测ACE2 蛋白的组织学定位。具体试验步骤如下：

(1) 将固定好的肾脏、小肠和胰腺组织取适当大小放入包埋盒中进行脱水，具体过程为75.0%乙醇1.5 h，95.0%乙醇1.5 h，95.0%乙醇1.0 h，99.5%乙醇1.5 h，99.5%乙醇1.0 h，二甲苯0.5 h (2 次)；

(2) 将脱水后的组织浸蜡3 次，对组织进行石蜡包埋；

(3) 将组织石蜡块修整至合适大小后固定于切片机上，调设切片机的参数设置，将石蜡块切成厚度为5～7 μm 的石蜡带，用毛笔和镊子将石蜡带托起，放入温水中铺平展开，载玻片倾斜入水后将石蜡带轻轻捞起，标注片子信息，烤片30 min；

(4) 将载玻片放入二甲苯溶液中进行脱蜡，重复2 次，每次10 min；随后将载玻片依次放入99.5%乙醇、95.0%乙醇、80.0%乙醇、70.0%乙醇和50.0%乙醇，最后放入蒸馏水，各步骤均限时2 min；

(5) 将载玻片放入装有按体积比1∶99 配制的柠檬酸修复液(现配现用)中，置于火上煮沸修复3～5 min，冷却后放入PBS 中洗3 次，每次3 min；

(6) 待甩干PBS 时，用组化笔圈出组织，在圈内滴加过氧化氢酶，37 ℃孵育20 min；用PBS 洗涤3 次，每次3 min，最后1 次用吸水纸吸去PBS 后，在圈内滴加3%链霉亲和素—生物素复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)，置于室温中封闭30 min；

(7) 吸去SABC，将载玻片平铺于切片盒内，并滴加一抗 (1∶100)，4 ℃冰箱孵育过夜；后用PBS 洗涤3 次，每次3 min，吸去组织周围PBS 后，滴加二抗，37 ℃温箱中孵育30 min；

(8) PBS 洗涤3 次，每次3 min，吸去PBS 后滴加现配的DAB 显色液50 μL，待圆圈内组织呈棕黄色时，用清水轻轻冲洗载玻片1 min，终止显色；

(9) 将载玻片依次浸泡于苏木素染液 (10 min)、盐酸酒精分化液 (30 s)和自来水 (10 min)；

(10) 将载玻片依次放入80.0%乙醇、95.0%乙醇、99.5%乙醇(2 次)，各3 min；之后再放入二甲苯(2 次)中透明，各4 min；

(11) 将中性树胶滴在组织旁，用盖玻片进行封片，晾干后使用光学显微镜观察并采集图像。

1.6 ACE2 蛋白的量化比较

通过光学显微镜观察，阳性表达呈棕色或棕褐色，蓝紫色为阴性。利用Image-Pro-Plus 6.0 图像分析软件测定图片的累计光密度值和面积，计算每张片子的平均光密度值，再计算每个样本的平均数。

1.7 数据统计与分析

所有数据均用“平均数±标准误”表示。采用SPSS 20.0 软件的单因素ANOVA 法分析ACE2基因在家猫各组织间的差异显著性；采用Graphpad Prism 8.0 制图。

2 结果与分析

2.1 荧光定量 PCR 法检测结果

2.1.1 家猫不同组织中ACE2基因mRNA 的表达

由图1 可知：ACE2基因mRNA 在小肠的表达量最高，其次按肾脏、胰腺、肝脏、肺脏、心脏、脾脏依次递减，在肠系膜淋巴结中的表达量最低。肾脏、胰腺和小肠组织的ACE2表达量极显著高于肺脏组织 (P＜0.01)，心脏、脾脏和肠系膜淋巴结组织的ACE2表达量极显著低于肺脏组织 (P＜0.01)，而肺脏与肝脏组织之间的ACE2表达差异不明显。

图1 各组织中ACE2mRNA 的表达水平Fig.1 Expression levels ofACE2mRNA in each tissues

2.1.2 不同性别家猫组织中ACE2基因mRNA 的表达

由图2 可知：不同性别家猫组织中，ACE2基因的表达量存在一定差异。其中，公猫肺脏、心脏、肝脏、小肠和胰腺组织的ACE2表达量较母猫高；而母猫肾脏、脾脏和肠系膜淋巴结组织的ACE2表达量较公猫高；但不同性别间各组织的ACE2表达量差异均不显著。

图2 不同性别家猫ACE2基因在各组织中的差异表达Fig.2 Differential expression ofACE2gene in different tissues of domestic cats of different sexes

2.2 免疫组织化学检测结果

2.2.1 肾脏、胰腺和小肠组织中ACE2 蛋白的定位

与阴性对照组相比，ACE2 蛋白在肾小管上皮细胞明显表达，主要以近端肾小管为主，在肾小囊壁层呈弱表达，肾小球未见明确阳性染色；在胰腺外分泌腺和内分泌腺(即胰岛)均有阳性表达，外分泌腺中导管细胞和腺泡细胞均有表达；在小肠上皮细胞刷状缘有较为丰富的表达，黏膜下层阳性表达较弱 (图3)。

图3 家猫ACE2 蛋白在肾脏、胰腺和小肠组织中的分布 (400×)Fig.3 Distribution of ACE2 protein in kidney,pancreas and small intestine tissue of domestic cat

2.2.2 不同组织中ACE2 蛋白的量化比较

由图4 可知：ACE2 蛋白在家猫小肠组织的表达量最高，其次是肾脏，在胰腺的表达量最低。ACE2 蛋白在小肠组织中的表达量极显著高于胰腺组织 (P＜0.01)，在肾脏组织中的表达量也显著高于胰腺组织 (P＜0.05)，但小肠组织与肾脏组织的ACE2 蛋白表达差异不显著。

图4 不同组织的ACE2 阳性反应平均光密度值Fig.4 Average optical density value of ACE2 positive reaction in different tissues

3 讨论

3.1 家猫ACE2基因组织分布的广泛性

已有研究表明：人的ACE2基因在小肠、肾、心和睾丸中呈现高表达，其中以小肠中表达量最高，而在免疫器官和神经器官中表达量较低[10]。本研究也表明：猫的ACE2基因mRNA在各组织中均有不同程度的表达，其中在小肠的相对表达量最高，其次是肾脏，这与ACE2在人类中表达的结果[11]相一致。BANERJEE 等[12]研究表明：ACE2不仅在人类胰腺中表达，且在胰腺的mRNA水平高于肺脏。此外，在本研究中心脏组织的ACE2表达量较肺脏组织低，这与人类心脏组织ACE2高表达的结果不符，但与谢旭东等[13]研究小鼠ACE2的组织分布性及表达量的结论相似，这可能是由于不同物种之间存在的差异所致，且组织样本质量、反转录以及试验过程中都存在一定的误差。由于ACE2位于X 染色体上[14]，所以有学者认为ACE2在不同性别之间的表达可能存在差异，而本研究中公猫和母猫同一组织中ACE2基因的表达无较大差异，这与HAN 等[15]从数据库中提取大量男性和女性不同组织中ACE2表达数据进行分析后得出的结论相一致。但在陈清贻等[16]对雪山草鸡研究中，母鸡空肠、盲肠、脾脏和肺脏的ACE2基因表达量显著高于公鸡，公鸡肾脏和心脏的ACE2基因表达量显著高于母鸡，这可能是试验对象或其生理不同所致。

3.2 家猫ACE2 蛋白组织定位

WILLIAMS 等[17]研究表明：小肠上皮细胞和肾小管上皮细胞中均有人ACE2 蛋白表达，这与本研究中家猫ACE2 蛋白在小肠和肾脏中表达的结果一致。此外，仔猪中小肠上皮细胞的刷状缘及浆膜层ACE2 蛋白表达也与本研究结果[18]一致。本研究表明：ACE2 蛋白在胰腺外分泌腺和内分泌腺中均有表达，与LIU 等[19]的研究结果一致。猫小肠组织的ACE2 蛋白高表达不仅表明SARS-CoV-2 可以在该位置与ACE2结合发生感染，并且有患猫检测出粪便SARS-CoV-2 阳性[20]。此外，本研究中ACE2 蛋白在小肠的表达高于肾脏和胰腺，这可能是因为ACE2 在小肠中与氨基酸转运蛋白结合，促进氨基酸在肠道中的吸收，与肠道的生长发育密切相关[21]。由于ACE2 蛋白的特殊性，一旦猫感染SARS-CoV-2，首先会在肠道组织中产生症状，因此，猫小肠可能是SARSCoV-2 重要的复制位点，推测SARS-CoV-2 可以通过粪便传播感染。

ACE2 作为与冠状病毒外壳S 糖蛋白结合的受体蛋白，且充当着为病毒入侵宿主提供信号转导的角色，故推测ACE2 与免疫性状密切相关，应该在免疫组织器官中有明显的变化。ACE2 在小肠中有较高的表达，推测可能ACE2基因与胃肠道生长发育有关。相关研究表明：ACE2 并不与肾中的氨基酸转运蛋白结合，而是与肠道中的氨基酸转运蛋白结合，所以ACE2在肠道中呈高表达[22]。因此，小肠中ACE2mRNA 的相对高表达提示ACE2可能在小肠的发育和生物学功能中发挥着重要作用。

4 结论

ACE2基因在家猫不同组织中表达量依次为小肠＞肾脏＞胰腺＞肝脏＞肺脏＞心脏＞肠系膜淋巴结＞脾脏，不同性别之间ACE2基因表达量差异不显著；ACE2 蛋白主要分布于肾小管上皮细胞、胰腺内分泌腺和外分泌腺以及小肠上皮细胞刷状缘。表明家猫ACE2基因组织分布具有广泛性。