高效毛细管电泳法测定金针菇提取物中β-烟酰胺单核苷酸含量的初步研究

马晓颖， 肖军， 陈珣， 龚娜， 刘国丽， 杨涛， 肇莹

（辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁省食用菌优质栽培重点实验室，沈阳 110161）

金针菇(Flammulina velutiper (Fr.) Sing.)学名毛柄金钱菌，又名冬菇、朴菰、冻菌、构菌等。早春和晚秋至初冬，在阔叶林腐木桩上或根部丛生，有白色和褐色品种[1]。金针菇的氨基酸含量丰富，其营养价值高、味鲜，被称为“增智菇”，是广为人知的食药用菌[2]；多糖成分具有抗癌功效[3]，对肺癌[4]和肝癌[5-6]效果显著；蛋白质、维生素[7]和脂肪可为人体提供能量，增强免疫力，具有降血脂、抗疲劳、抗氧化[8]等功效；膳食纤维和微量元素有助于营养吸收；赖氨酸和精氨酸的含量明显高于其他菇类[2]；另外金针素还具有缓解疲劳的作用[9]。在我国，金针菇栽培起步很早，但到20 世纪80 年代后才真正实现商品化，目前以白色品种为主，主要有袋栽和瓶栽2 种工厂化生产模式。β-烟酰胺单核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide，NMN）是一种单核苷类化合物，能够显著改善小鼠的生理机能衰退，增强能量代谢，改善胰岛素敏感性和血浆中脂质的分布情况，并且可以改善眼部功能[10]。据报道，NMN 主要存在于蔬菜、水果中[11]，未见有关于金针菇中β-烟酰胺单核苷酸含量的研究报道。

毛细管电泳技术(high performance capillary clectrophoresis，HPCE)是一种高效分离分析技术，依据样品各成分淌度和分配行为上的差异以高压电场为驱动而实现分离，其柱效可比高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)高1～2 个数量级，复杂样品的特征性也远远高于HPLC[12]，具有所需样品少、灵敏度高、成本低、抗污染能力强、柱效高、自动化程度高等优点，在医药诊断、刑事侦查、环境监测等方面发挥了一定的作用[13]。现有技术中关于β-烟酰胺单核苷酸含量测定方法比较常用的是液相色谱方法，但是该方法需要用到的色谱柱经常需要维护，成本高，并且全程使用有机溶剂，在测定过程中溶剂挥发会影响操作者的健康，测定结束后的有机废液也需要特殊处理，排放的过程也会有污染。本研究提供的金针菇中β-烟酰胺单核苷酸含量的毛细管电泳测定方法，在毛细管运行过程中不需要有机溶剂，缓冲液为无机盐溶液没有挥发性，可以减少有机溶剂的污染，对人和环境都比较友好。本研究以金针菇的提取液为测定对象，利用高效毛细管电泳法测定金针菇中β-烟酰胺单核苷酸含量，实现了β-烟酰胺单核苷酸的定性和定量的测定，该方法简单可靠，既可以测定金针菇提取液中的β-烟酰胺单核苷酸，也可以将此方法应用到其他的食用菌品种中去。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金针菇子实体来源于辽宁省沈阳市恒生生物有限公司；金针菇品种来源于韩国；β-烟酰胺单核苷酸标准品购自北京奥博星生物技术有限责任公司；试验中用的试剂均为分析纯和色谱纯；试验用水为超纯水，Na2B4O7、H3BO3、Na2HPO4、NaH2PO4为美国Amresco生物试剂公司生产。

试验用仪器：P/ACE MDQ 毛细管电泳仪（美国贝克曼公司）、电子天平（ME204E 梅特勒-托利多仪器有限公司）、精密pH计（北京泰亚赛福科技发展有限责任公司）、HZQ-QX 全温振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、干热消毒箱（上海精宏实验设备有限公司）、超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、Cascada™实验室超纯水系统（Pall corporation）、微孔滤膜（孔径0.22 μm，津隆设备有限公司）和A11 高速粉碎机（德国IKA集团）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品溶液的制备 取20 g 金针菇子实体60 ℃烘干，粉碎，过400目筛，得到菌粉按照1 g干重加水15 mL 的比例加水混合,65 ℃超声30 min，抽滤后取上清液，将过滤好的提取物用0.22 μm孔径的水系滤膜滤过，4 ℃保存待用[14]。

1.2.2 β-烟酰胺单核苷酸的配制 用精密天平称取5 mg β-烟酰胺单核苷酸，放到1.5 mL 的离心管中，用1.0 mL 超纯水溶解，配成5 mg·mL-1的对照品母液，水系滤膜过滤备用，冰箱4 ℃避光保存。

1.2.3 毛细管电泳分离条件的确定 为了获得分离度比较好的峰型，分别对不同的缓冲液进行了筛选，电泳操作条件如下：①30 mmol·L-1硼砂缓冲液pH 分别为8.0、8.5、9.0、9.5；②50 mmol·L-1柠檬酸缓冲液pH 分别为5.5、6.0、6.5；③20 mmol·L-1磷酸缓冲液pH分别为7.0、7.5。

其他条件：毛细管有效检测长度57 cm，内径为30 μm，电泳温度25 ℃，进样时间5 s，进样压力0.5 psi，电压25 kV，紫外检测波长218 nm。

1.2.4 特异性考察 吸取5 mg·mL-1的β-烟酰胺单核苷酸10 μL，加入到100 μL的金针菇提取物上清液中，配成β-烟酰胺单核苷酸浓度为5 μg·mL-1的混合液；将单独NMN、单独金针菇提取物以及金针菇加NMN 的混合液依次进样。进样5 次，观察检测峰附近是否存在干扰峰，用以判断方法的特异性[15]。

1.2.5 标准曲线建立 将β-烟酰胺单核苷酸配成5 mg·mL-1的母液，用超纯水溶解。将β-烟酰胺单核苷酸标准品配成质量浓度为0.03、0.20、0.50、1.00、2.00 mg·mL-1，依次进样测定。以标准品质量浓度x（mg·mL-1）为横坐标，标准品峰面积y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程以测定质量浓度。

1.2.6 灵敏度测定 将得到的β-烟酰胺单核苷酸标准品加到金针菇子实体提取液中，进行无限稀释，再按照1.2.3 电泳条件分别进样，找到信噪比（S/N）为3 的以确定检测限（limit of detection，LOD）。

1.2.7 回收率测定 将已知含量的金针菇样品中按照测定的质量浓度分别加入300%、100%和30% 3 种不同量β-烟酰胺单核苷酸的标准溶液，按照制备方法配制并进行高效毛细管电泳进样测定，利用下面公式计算加样的回收率。

1.2.8 方法的精密度和稳定性测定 精密度是指在规定条件下，用1个均匀样品，经多次取样测定所得各个结果之间的接近程度[16]。取β-烟酰胺单核苷酸对照品溶液按照供试品溶液的制备和检测方法进行5 次检测，考察色谱峰保留时间的一致性，记录出峰时间和峰面积，将同1份β-烟酰胺单核苷酸（NMN）对照品，按照配制方法溶解后，分别在0、2、4、6、8 h不同的时间点进行检测，以主要峰面积计算，考察样品的稳定性。

1.3 数据分析

采用BECKMAN 高效毛细管电泳仪自带的32Karat 8.0 软件处理图谱，采用Excel 软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 高效毛细管电泳分离条件的确定

为了获得分离度比较好的峰型，分别对不同的缓冲液进行了筛选，结果表明，在pH≤7.0 时样品各成分的电流淌度差别不大，无法分离样品组分。当缓冲液pH增加时，样品中各成分电流淌度的差别开始明显，分离效果增加。在pH 9.0～9.5时，缓冲液分离能力较强，分离效果相对较好。经过不同条件的优化得出最佳分离条件为：电泳缓冲液为30 mmol·L-1硼砂和10 mmol·L-1磷酸二氢钠，pH为9.2，电泳温度为25 ℃，进样时间为5 s，进样压力为0.5 psi，电压为25 kV，紫外检测波长218 nm。

2.2 方法特异性检测结果

由HPCE 结果看出，β-烟酰胺单核苷酸的对照品在8.08 min 时有特征峰出现，峰性稳定良好，无肩峰和拖尾峰。金针菇提取液也在相同时间有特征峰，且加入对照品的金针菇提取液的图谱中相应β-烟酰胺单核苷酸的位置峰高和峰面积变大，表明在金针菇提取液中含有β-烟酰胺单核苷酸，且该方法可以用于定性和定量分析。

2.3 标准曲线的建立结果

在最佳毛细管电泳分离条件下，以β-烟酰胺单核苷酸对照品质量浓度x（mg·mL-1）为横坐标，β-烟酰胺单核苷酸峰面积y为纵坐标得线性回归方程：y=2E+6x-345.69，R2=0.999 4，表明该曲线的线性关系良好。由图2 可知不同质量浓度的标准品重复性较高；图3 表明β-烟酰胺单核苷酸标准品峰面积和质量浓度的线性关系较好。将样品峰的峰面积带入方程，得β-烟酰胺单核苷酸的含量为27.57 μg·mL-1。

图1 内标法测定β-烟酰胺单核苷酸的试验结果图谱Fig. 1 Chromatogram of the determination of β-nicotinamide mononucleotide by internal standard method

图2 不同浓度的β-烟酰胺单核苷酸的电泳图谱Fig. 2 Capillary electrophoresis of β-nicotinamide mononucleotide at different concentrations

图3 β-烟酰胺单核苷酸的标准曲线Fig. 3 Standard curve of β-nicotinamide mononucleotide

2.4 灵敏度测定结果

选择线性最小质量浓度10 μg·mL-1的样品进样，进样后主峰峰高是20 mV，定量限质量浓度为浓度/峰高，也就是0.5 μg·mL-1。用标准品添加到样品中的方式来考察灵敏度。检测限质量浓度为定量限除以3，测得β-烟酰胺单核苷酸在金针菇提取液中的检测限LOD为0.17 μg·mL-1。

2.5 加样回收试验结果

在金针菇提取物测得的β-烟酰胺单核苷酸浓度基础上添加低、中、高质量浓度的标准品，在最佳电泳条件下进样，将测得的峰面积带入到标准方程中，得出的含量再除以理论含量，得到回收率。结果（表1）表明β-烟酰胺单核苷酸平均回收率在89%～94%之间，表明该方法适用于金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的测定。

表1 金针菇样品中添加β-烟酰胺单核苷酸的回收率Table 1 Recovery of the samples added β-nicotinamide mononucleotide

2.6 进样精密度和稳定性考察结果

取β-烟酰胺单核苷酸对照品溶液按照供试品溶液的制备和检测方法进行5 次检测，考察色谱峰保留时间的一致性，记录出峰时间和峰面积，计算β-烟酰胺单核苷酸出峰时间相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）为0.68%；峰面积的RSD 为1.44%，表明该方法的精密度良好。分别在0、2、4、6、8 h不同的时间点进行检测，以主要峰面积计算，考察样品的稳定性。β-烟酰胺单核苷酸位置的出峰时间RSD 为1.26%；峰面积 RSD为2.82%（图4），表明样品在8 h内是稳定的。

图4 不同放置时间的β-烟酰胺单核苷酸毛细管电泳图谱Fig. 4 Capillary electrophoresis of β-nicotinamide mononucleotide at different times

3 讨论

β-烟酰胺单核苷酸承担着人体细胞能量生成的重要任务，参与细胞内烟酰胺嘌呤二核苷酸的合成，并且对衰老相关的疾病有一定的防治作用[17]。β-烟酰胺单核苷酸存在于多种生物体内，李东芹[18]在西兰花、卷心菜和牛油果中检测到了烟酰胺单核苷酸；刘小芳等[19]利用液质联用测定方法，发现番茄、香菇、黄豆、鳄梨、对虾、南极磷虾为β-烟酰胺单核苷酸天然食物来源。孟辰笑凝等[20]以对苯二酚为内标建立了β-烟酰胺单核苷酸核磁共振氢谱测定法。目前测定单核苷类化合物通常用高效液相的方法[21]，HPLC 是以经典液相色谱法为基础,引入GC 的理论与试验方法发展而成的分离分析方法。但是如果样品纯度不够，容易造成色谱柱中毒是高效液相色谱法测定有效成分的缺点。液相色谱需要的上样量比较大，且样品处理比较复杂，若样品的粘稠度过高易堵塞色谱柱。而有的食用菌野生资源的采集样本量比较少，经常达不到液相色谱的上样条件，这样对食用菌品种中有效成分的测定就不全面。毛细管电泳的分离和富集模式多，已成为发展迅速的色谱技术之一[22]。所有液相色谱的分离模式，包括正相、反相、离子交换、亲和、筛分等都可以在毛细管电泳中找到相应的模式[23]。本文提供的金针菇中β-烟酰胺单核苷酸含量的毛细管电泳测定方法可以避免这种现象。毛细管电泳一次进样量是微克级别，一般食用菌都可以达到，对于一些比较珍贵的样本可行性更高。本研究对毛细管电泳中β-烟酰胺单核苷酸物质分离需要的不同参数进行优化，得到分离效果较好的方法，除了本文的金针菇内相关物质的测定，还可以应用于其他的样品测定。高效毛细管电泳还具有分离效率高、分析速度快、样品和试剂用量少等特点，是更为环保、无害、便捷的检测方法，可以广泛地应用于各种领域。