陆地棉BGLU基因家族成员的全基因组鉴定与表达分析

张曼， 王志城， 刘正文， 王国宁， 王省芬， 张艳

（河北农业大学农学院，华北作物改良与调控国家重点实验室，河北省作物种质资源重点实验室，河北 保定 071000）

棉花是重要的经济作物，对中国经济发展有着重要的作用。继二倍体雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）[1]和亚洲棉(Gossypium arboreum)[2]测序完成，生产上应用最广泛的陆地棉（Gossypium hirsutum）和海岛棉（Gossypium barabdense）基因组序列也已绘制完成[3-4]，标志着棉花研究进入了后基因组时代，为开展基因家族的全基因组鉴定与生物信息学分析提供了基础信息。

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）EC3.2.1.21，又称β-D-葡萄糖糖苷水解酶，属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分。β-葡萄糖苷酶能够从含糖化合物中催化水解末端的非还原性β-D-葡萄糖苷键，同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基[5]。在高等植物中，β-葡萄糖苷酶主要包括糖基水解酶家族1 (glycoside hydrolase family 1,GH1)[6]，其广泛参与防御反应[7]、细胞壁木质化[8]、植物激素信号激活[9-10]和次生代谢[11]等重要生理过程。通过对β-葡萄糖苷酶家族的系统发育进行分析，发现拟南芥AtBGLU45、AtBGLU46和AtBGLU47与松柏（Pinus contorta conifin）β-葡萄糖苷酶基因聚为一类，它们可能通过水解单酚苷参与木质化过程[12]。抑制水稻Os3BGLU6的表达导致植株矮化、叶片中ABA 含量降低、干旱敏感性增加、光合速率降低、细胞间CO2浓度升高，影响植株的耐旱性[13]。比较分析5 种蔷薇科植物的β-葡萄糖苷酶家族全基因组发现，梨(Pyrus bretschneideri)果实中BGLU基因与木质化和石细胞发育有关[14]。水稻（Orazy sativa）中的OsGH3基因可以调控生长激素、茉莉酸和水杨酸信号通路之间的串联，从而影响水稻对生物和非生物胁迫的耐受性[15]。β-葡萄糖苷酶家族除了参与植物的细胞壁代谢及激素的激活外，还在植物逆境胁迫的防御反应中起重要作用。

生物信息学在全基因组分析中发挥着越来越重要的作用，棉花的多个重要基因家族已经通过全基因组分析取得了重要成果[16-17]。目前，从基因组水平解析棉花β-葡萄糖苷酶基因（BGLU）家族的相关研究还未见报道。本研究从全基因组水平鉴定了陆地棉中的BGLU基因家族成员，对各成员的基因结构、染色体定位、系统进化关系、启动子调控元件等进行了系统分析，并结合黄萎病菌处理后的抗病‘农大601'的转录组数据对参与黄萎病抗性反应的GhBGLU基因进行了筛选和相关qPCR 验证，为后续深入研究BGLU基因在陆地棉中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 GhBGLU基因家族的鉴定

根据GhBGLU基因序列对最新版本的高质量陆地棉基因组（https://cottonfgd.org/）进行BLAST搜索，确定候选基因，进一步利用GhBGLU家族特有保守结构域（PF00232）通过Pfam 数据库[18]（http://pfam.xfam.org/）和NCBI CD-Search 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）进行验证，剔除冗余序列后，最终得到陆地棉BGLU家族成员的序列。

1.2 GhBGLU家族多重序列比对及进化树构建

通过Clustal W 程序对陆地棉BGLU 氨基酸序列进行多序列比对[19]，利用MEGA 7.0 软件的邻接法（Neighbor-Joining, NJ）构建系统进化树，Bootstrap重复测试（replications）设置为1 000。

1.3 GhBGLU家族基因生物信息学分析

利用在线软件MEME （http://meme.sdsc.edu/meme/）分析保守结构域，结合GhBGLU家族基因外显子-内含子结构，利用TBtools 进行可视化。根据基因组结构注释文件的基因信息可知各BGLU家族成员在染色体上的位置，利用MapChart 软件进行基因染色体定位。使用MCScanX 软件对陆地棉GhBGLU家族成员的共线性进行分析[20]，最后使用Circos 软件对结果进行可视化展示[21]。利用TBtools 软件对共线性基因进行Ka/Ks计算，并评估其进化选择方向[22]。从陆地棉基因组数据库中选取BGLU家族中起始密码子ATG 上游2 000 bp 的序列，利用PlantCARE 数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析其可能存在的顺式作用元件，筛选后利用TBtools软件作图。

1.4 GhBGLU 基因家族在黄萎病胁迫下的表达量热图绘制

利用本实验室大丽轮枝菌胁迫的棉花转录组数据库[23]进行BGLU家族基因表达模式分析，使用TBtools 软件绘制BGLU基因家族各成员表达量热图。

1.5 GhBGLU基因的qRT-PCR

以本实验室保存的陆地棉抗病品种‘农大601'（ND601）为材料，在黄萎病菌胁迫6、12、24、36、48 h后取根部样品，提取RNA并进行Real-time PCR。以UBQ作为内参，采用 2-△△CT法[24]计算基因的相对表达量，每个基因的表达反应有3个生物重复和3个技术重复。本文所用引物详见表1。

表1 本研究中所用qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR in this study

2 结果与分析

2.1 GhBGLU基因家族鉴定与理化性质分析

在陆地棉‘TM-1'基因组中共鉴定到53 个编码GhBGLU基因的家族成员，根据它们在染色体上的位置分别命名为GhBGLU01～GhBGLU53（表2）。GhBGLU基因编码的氨基酸范围在121～546 aa 之间，蛋白质分子量分布在13.9～66.3 kD 之间；等电点变化范围则从4.694～9.728。利用不同的软件对GhBGLU基因家族成员进行亚细胞定位预测，分析结果显示，GhBGLU家族不同成员定位于细胞质膜、液泡、胞质、胞外和溶酶体中。信号肽预测发现，53 个基因家族成员在N 末端均存在信号肽，且有16 个成员含有跨膜域，推测它们可能为分泌蛋白。

2.2 GhBGLU家族基因的系统发育分析

基于陆地棉和拟南芥蛋白序列构建系统发育树，GhBGLU基因被分为6 个亚家族（A～F）（图1），每个亚族均同时包含GhBGLU和AtBGLU基因，表明这些成员功能保守。AT1G52400、AT2G44490、AT5G57220、AT1G51490、AT3G09260等基因参与了拟南芥对病菌及虫害的防御反应[25]。另外，拟南芥AT2G44450可催化黄酮类物质的合成反应[26]；AT3G09260、AT3G15950参与了茉莉酸调控通路[27]；AT5G52310、AT5G60360通过调节脱落酸水解活性在拟南芥渗透胁迫响应中起重要作用[28]。根据同源进化关系，推测棉花中与拟南芥同源的这些基因可能参与了棉花对生物、非生物的胁迫响应。

图1 陆地棉和拟南芥BGLU基因家族进化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of BGLU proteins in G. hirsutum and Arabidopsis

2.3 GhBGLU 家族基因的染色体定位、基因结构和保守域分析

根据基因位置信息，发现陆地棉中53 个GhBGLU基因不均匀地分布在除A 亚组第3、4 号染色体和D亚组第2、4号染色之外的22条染色体上，且主要分布在染色体两端（图2）。此外，GhBGLU在A、D亚基因组间无明显偏好性。

图2 陆地棉BGLU基因家族成员的染色体分布Fig. 2 Chromosomal location of the GhBGLU genes in G. hirsutum

陆地棉GhBGLU基因编码的蛋白含有8 种motif，分别命名为motif 1～motif 8（图3）。这些motif 在GhBGLU家族大部分成员中均有出现，为该家族的保守基序，推测其在该家族中行使基本功能。GhBGLU家族外显子个数变异较大，GhBGLU17、GhBGLU38、GhBGLU44仅含有1 个外显子，而GhBGLU4基因含有的外显子高达14 个。大豆[29]和水稻[30]中外显子数目基本在11～13 左右，个别基因出现了8～9个。

图3 陆地棉GhBGLU基因家族保守基序Fig. 3 Conserved motifs of GhBGLU gene family in G. hirsutum

2.4 GhBGLU 家族基因共线性及顺式作用元件分析

为研究GhBGLU家族基因进化的关系，使用MCScanX 软件进行共线性分析，共发现21对共线性基因对。A、D 亚组中均发现2 对片段复制基因，A 亚组和D 亚组之间有17 对同源基因呈绝对共线性（图4）。通过计算上述基因对的非同义突变率与同义突变率的比值（Ka/Ks）发现，同源基因对的Ka/Ks均小于1，表明这些基因在进化过程中受到了纯化选择。

图4 陆地棉GhBGLU共线性分析Fig.4 Collinearity analysis of GhBGLU in G. hirsutum

通过对GhBGLU基因上游2 000 bp 序列的启动子区顺式作用元件进行分析发现，存在与激素信号相关的脱落酸（abscisic acid, ABA）响应元件、赤霉素（gibberellic acid, GA）响应元件、auxin响应元件、水杨酸（salicyclic acid, SA）应答元件、茉莉酸甲酶（methyl jasmonate, MeJA)应答元件以及与环境胁迫相关的低温应答元件、干旱应答元件和防御胁迫应答元件（图5），其中，MeJA 反应元件最丰富（121 个）。上述应答元件的富集表明，棉花BGLU基因可能参与了植物对各种病原菌及环境胁迫的响应。

图5 陆地棉GhBGLU启动子顺式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-acting elements of GhBGLU promoter in G. hirsutum

2.5 黄萎病菌胁迫下GhBGLU基因表达分析

利用黄萎病菌胁迫下抗病陆地棉农大601 的转录组数据库[23]，依据GhBGLU基因家族成员接菌后不同时间点的RPKM 值构建基因表达热图，共筛选出33个GhBGLU基因在大丽轮枝菌胁迫下差异表达（图6），表现为2 种模式：一种是基因在病菌胁迫处理后表达量出现上升趋势，包括GhBGLU5、GhBGLU34等，表明这些基因在棉花抗黄萎病反应中起正调控作用；另一种是在黄萎病菌处理后基因表达量呈现出下降趋势，包括GhBGLU22、GhBGLU52等，表明这些基因在棉花抗黄萎病反应中起负调控作用。

图6 陆地棉大丽轮枝菌胁迫下GhBGLU基因表达分析Fig. 6 GhBGLU genes expression under Verticillium dahliae stress

2.6 不同抗性棉花品种中GhBGLU基因的表达分析

为明确上述响应大丽轮枝菌胁迫的GhBGLU基因是否参与棉花抗病反应，从表达差异明显的基因中挑选了9 个成员，进一步在不同抗感棉花品种中检测这9 个基因的表达水平（图7）。荧光定 量PCR 结 果 显 示，GhBGLU5、GhBGLU14、GhBGLU18、GhBGLU26、GhBGLU34、GhBGLU33在受到黄萎病菌胁迫后，表达量显著提高，且在抗病品种‘ND601'中的表达量显著高于感病品种‘CCRI8'，推测上述基因正向调控棉花黄萎病的抗性。GhBGLU22、GhBGLU40、GhBGLU52表达量在‘ND601'中显著下调，但在‘CCRI8'中的表达没有明显规律，需要进一步研究其参与黄萎病菌抗性的作用方式。此外，在接菌后12 h 的抗病品种‘澳SiV2'和感病品种‘湘棉18'的转录组数据中也发现，上述9个基因中的7个基因在‘澳SiV2'的转录水平高于‘湘棉18'中，与荧光定量结果较吻合。结合抗感品荧光定量和转录组测序结果，推测GhBGLU5、GhBGLU14、GhBGLU18、GhBGLU26、GhBGLU34在抗黄萎病反应中起正调控作用。

图7 黄萎病菌胁迫下9个GhBGLU基因的表达分析Fig. 7 Analysis of the expression of 9 GhBGLU genes under the stress of V. dahliae

3 讨论

β-葡萄糖糖苷酶参与植物体内的各类生理过程，主要在植物次生代谢及逆境胁迫中发挥重要作用[5]。本研究利用生物信息学手段从陆地棉中共鉴定出53 个BGLU家族基因，它们不均匀地分布在22 条染色体上，且主要分布在染色体两端，包含8 个典型保守基序。大多数BGLU家族基因都是成对出现的，同源性高，推测这些基因在功能上有一定的相似性。通过系统发育分析，53 个BGLU家族基因被分为6 个亚组，且每个亚组均有拟南芥出现，表明棉花BGLU基因与拟南芥BGLU基因具有同源性，但是拟南芥成员分布不均，导致棉花在某些蛋白序列表现出进化过程中的差异，可能和物种的自然选择有关系。共线性分析发现了21 对基因对，同源基因对的Ka/Ks均小于1，表明这些基因在进化过程中受到了纯化选择。亚细胞定位结果显示这些成员均定位在胞外，N 端均存在信号肽，表明该家族基因功能保守。

通过对几种已测序的模式植物进行研究，如拟南芥[31]、苜蓿[32]、玉米[33]、水稻[34]，发现BGLU基因均响应生物和非生物胁迫，与激活植物激素和防御化合物相关。植物BGLU基因家族对病菌胁迫有着不同程度的响应，其应答机制也不尽相同，拟南芥BGLU基因家族与抗病相关的通路均有关联，如木质素[35]、水杨酸[36]、黄酮醇[37]、乙烯[38]。AtBGLU6(AT1g60270)过表达可以调控异黄酮的积累，提高植物对病菌胁迫防御。OsbspP(BGLU_RS28885)的缺失减弱了水稻稻瘟病对寄主的侵染力。研究表明，GhBGLU与β-1，3-葡聚糖酶同属于GH 超家族，定位于液泡和胞外的β-1，3-葡聚糖酶可以通过降解真菌细胞壁相关成分对病原菌进行防御[39-40]，亚细胞定位预测将GhBGLU家族中的多个成员定位在液泡或胞外，推测其可能与β-1，3-葡聚糖酶发挥类似的功能。

本研究分析了陆地棉BGLU基因家族对黄萎病胁迫的响应，发现大多数GhBGLU基因受黄萎病菌胁迫后显著表达，表明棉花可通过调控部分BGLU基因来提高植物对病原菌抗性。对GhBGLU基因家族进行顺式作用元件分析，发现多个与抗病相关的应答元件，如多种激素应答元件、防御相关应答元件和非生物胁迫应答元件等。植物激素水杨酸、茉莉酸被认为是植物抗病防卫反应的内源及中间信号分子，而MeJA 作为数目最多的应答元件可以直接对病原菌起到抑制作用，并作为抗病防卫反应的内源及中间信号分子发挥作用[41]。因此，推测GhBGLU基因启动子序列中植物激素响应元件可能调控棉花抗病过程。根据qRT-PCR 结果，棉花中有6 个GhBGLU基因受黄萎病菌诱导后表达量显著上调，3 个GhBGLU基因受黄萎病菌诱导后表达量显著下调，这些BGLU基因可能作为介导棉花对黄萎病抗性的调控因子，在响应黄萎病胁迫中具有重要作用，具体的抗病机制还需要进一步研究。