黄连解毒液对大鼠放射性皮炎生长因子的影响

李 阔，李 静

（西南医科大学附属中医医院肿瘤血液病科，四川 泸州 646000）

近年来，随着恶性肿瘤发病率的不断上升，放射治疗（放疗）的应用频率也在不断增加。患者在接受放疗后易出现一系列的不良反应，其中放射性皮炎是主要的不良反应之一[1]。若患者出现严重的放射性皮炎，不仅会使治疗中断，同时也会大大降低其生活质量。有研究显示，对皮肤进行放射性照射，仅仅5 Gy的剂量就会引起皮肤红斑，若剂量加大，还可引起皮肤溃疡、剥脱[2]。目前，针对放射性皮炎尚无有效的治疗手段。基于祖国传统医学中“治未病”的观点，我科根据《外台秘要》中的“黄连解毒汤”制成“黄连解毒液”。通过前期的临床试验证实，局部预防性涂擦黄连解毒液可以有效预防、治疗放射性皮炎[3-4]。但黄连解毒液预防、治疗放射性皮炎的作用机制尚不明确。因此，有必要通过严谨的科学思维和客观的科学实验，明确黄连解毒液促进放射性皮炎修复、愈合的机制，加强祖国医学与转化医学的联系，为临床治疗放射性皮炎提供理论基础。

1 材料

1.1 实验动物

8 周龄雌性Wistar 大鼠56 只，先在饲养观察室内观察3 d 后再进行动物实验。大鼠体重（200±20）g，由四川省实验动物饲养中心同批喂养，动物饲养环境的温度为（25±1）℃，湿度为65%。所有大鼠实验均按照动物保护法进行，并经西南医科大学附属中医医院伦理委员会批准。

1.2 主要药品和试剂

药品：黄连解毒液，由黄连、黄芩、黄柏、紫草、冰片、麻油组成，并由西南医科大学附属中医医院制剂室按外用油剂生产工艺流程制备，规格为100 mL/瓶；人表皮生长因子外用溶液（由深圳华生元基因工程发展有限公司生产）；生理盐水。试剂：抗大鼠EGF 单克隆抗体、抗大鼠EGFR 单克隆抗体、抗大鼠VEGF单克隆抗体、抗大鼠VEGFR 单克隆抗体、抗大鼠bFGF 单克隆抗体、抗大鼠bFGFR 单克隆抗体、抗大鼠TGF 单克隆抗体、抗大鼠TGFR 单克隆抗体、抗大鼠PGDF 单克隆抗体、抗大鼠PGDFR 单克隆抗体。

1.3 照射仪器

医科达Elekta Compact（射线性质和能量：6MV X 射线，剂量率为350 MU/min，剂量均匀性为±3.0%）；Q550CW 图像信号采集与分析系统（德国制造）。

1.4 方法

1.4.1 模型建立：给予Wistar 大鼠Ⅳ度放射性皮炎造模 1% 戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，将Wistar 大鼠固定于特制的照射架上，暴露左下肢，用饱和硫化钠与等量滑石粉制成的糊剂对大鼠的照射部位进行脱毛，照射面积为2.0 cm×2.0 cm，身体其他部位用铅板屏蔽，以直线加速器电子线6 MeV 单次照射。照射距离100 cm，照射剂量60 Gy，一次照射即建成大鼠Ⅳ度放射性皮炎模型。放疗计划及放疗均由放疗医师完成。

1.4.2 动物分组和给药 将Wistar 大鼠按随机数表法分为四组：正常组、空白组、对照组和治疗组，正常组（不建模）8 只，空白组、对照组和治疗组（此三组建模）各16 只，全部单笼饲养。造模成功的当天开始给予治疗。空白组给予生理盐水外敷创面，对照组给予人表皮生长因子外用溶液外敷创面，治疗组给予黄连解毒液外敷创面。各组均每天外敷2 次，给药量均为1 mL，连续给药28 d。

1.5 观察指标

1.5.1 创面愈合率和愈合时间 所有大鼠均从给药第1天起拍摄记录左后肢放射性皮炎部位的皮损情况。记录各时间点的创面愈合情况，测出创面面积，计算各时间点的创面愈合率。以创面完全上皮化、无渗出作为创面完全愈合的依据，记录创面愈合时间。创面愈合率=（1- 现在的伤口面积）/ 初始伤口面积×100%。

1.5.2 病理染色及免疫组化检测细胞因子含量 分别于照射后第7 天、第14 天、第21 天、第28 天各取空白组、对照组及治疗组大鼠4 只，颈椎脱臼处死后切取左后肢照射野皮肤组织1 cm×l cm，在10% 甲醛溶液中固定，24 h 后常规石蜡包埋，4 μm 厚连续切片，储于-70 ℃的冰箱中备用。常规行苏木精- 伊红（HE）染色，封片，光镜观察。按照各细胞生长因子试剂盒说明书对其切片进行染色，黄色表示为阳性，然后通过Q550CW 图像信号采集系统对其进行处理，进而计算出各生长因子的表达量。本实验中检测的生长因子包括表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点创面愈合率的对比

治疗1 周、2 周、3 周及4 周后，对照组、治疗组大鼠的创面愈合率均高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组的创面愈合率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 各组大鼠不同时间点创面愈合率的对比（%，± s）

表1 各组大鼠不同时间点创面愈合率的对比（%，± s）

注：b 与空白组对比，P ＜0.05；c 与对照组对比，P ＜0.05。

组别 治疗1 周后 治疗2 周后 治疗3 周后 治疗4 周后正常组（n=8）- - - -空白组（n=16）15.48±4.32 18.47±4.28 21.75±4.48 31.08±3.54对照组（n=16）19.67±4.21b 27.39±2.99b 49.67±2.85b 69.51±3.82b治疗组（n=16）24.36±1.89bc 41.62±4.62bc 69.57±1.59bc 85.62±7.45bc

2.2 各组创面组织愈合情况的对比

空白组经HE 染色见创面表皮角化，部分表皮内水泡形成，真皮充血水肿，大量炎症细胞浸润。第4周时，对照组、治疗组的创面损伤程度均明显改善，且创面组织修复程度均优于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图1。

图1 第4 周时各组大鼠创面的病理组织学变化（HE，×200）

2.3 治疗后各组大鼠创面组织中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF 表达情况的对比

治疗后，与空白组相比，对照组和治疗组创面组织 中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、FDGF 的 表 达水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，治疗组创面组织中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、FDGF 的表达水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

表2 治疗后各组大鼠创面组织中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF 表达情况的对比（± s）

表2 治疗后各组大鼠创面组织中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF 表达情况的对比（± s）

注：a 与正常组对比，P ＜0.05；b 与空白组对比，P ＜0.05；c 与对照组对比，P ＜0.05。

组别 EGF（μg/mL）VEGF（pg/mL）bFGF（pg/mL）TGF-β（pg/mL）PDGF（pg/mL）正常组（n=8）54.25±5.24 58.65±6.08 52.38±4.92 51.65±3.78 57.38±5.45空白组（n=16）139.48±12.36a 167.25±13.02a 148.76±12.54a 152.37±11.35a 144.76±10.26a对照组（n=16）110.31±10.78ab 125.54±14.36ab 109.62±10.35ab 121.05±10.76ab 115.38±10.41ab治疗组（n=16）85.69±8.62abc 100.05±9.87abc 88.76±6.53abc 101.38±9.48abc 98.76±9.59abc

3 讨论

中医学认为，放射线是“火热毒邪”，放射性皮炎是由于热毒过盛、热邪伤阴引起皮肤脱屑、红斑、瘙痒、溃疡等，故治疗上应以清热凉血、泻火解毒、去腐生肌、活血化瘀为主，且后期应辅以滋阴治疗[5]。早在《金匮要略》中，医圣张仲景就提到“浸淫疮，黄连粉主之”。中医药治疗放射性皮炎常以紫草、黄连、黄芩、黄柏等为主药，这些都是清热解毒的要药[6]。其中紫草味苦、性寒，有研究人员应用紫草液喷雾剂预防鼻咽癌患者放疗后并发Ⅲ级及以上放射性皮炎，结果显示患者Ⅲ级及以上放射性皮炎的发生率仅为3%[7]。以黄芩、黄柏、黄连等为主要成分的湿润烧伤膏具有清热解毒、渗湿敛疮的作用。有学者临床观察76 例肿瘤放疗患者外用美宝湿润浇伤膏的效果，结果显示较应用凡士林乳膏的患者急性皮肤反应程度明显减轻，美宝湿润烧伤膏可提高放射区皮肤对放射线的耐受性[8]。

bFGF 是一种肝素结合生长因子，能够对机体的血管内皮细胞、神经外胚层以及间叶细胞等细胞的增殖起到很好的促进作用，同时还具有一定的促血管生成活性，当机体的皮肤受到放射性损伤时，其表达会升高[9]。VEGF 能够促进血管生成，增加血管的通透性，当机体皮肤受到放射性损伤时，VEGF 就会大量表达，以促进皮肤的修复[10]。EGF 是一种能够促进表皮生长的细胞生长因子，可很好地改善皮肤损伤，加速伤口的愈合[11]。TGF-β 既能促进胶原蛋白的生成，又能将伤口中相关酶的作用减弱，进而可使得创口的愈合速度加快[12]。PDGF 对于维持正常血管形成的稳定性至关重要[13]。对于放射性皮炎大鼠，在利用黄连解毒液进行治疗时，检测其生长因子的表达水平能够很好地反映药效及治疗效果。

本研究结果显示，治疗1 周、2 周、3 周及4 周后，对照组、治疗组大鼠的创面愈合率均高于空白组（P＜0.05）；治疗组的创面愈合率均高于对照组（P＜0.05）；第4 周时，对照组、治疗组的创面损伤程度均明显改善，且创面组织修复程度均优于空白组（P＜0.05）；治疗后，与空白组相比，对照组和治疗组创面组织中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、FDGF的表达水平均降低（P＜0.05）；与对照组相比，治疗组创面组织中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、FDGF的表达水平均降低（P＜0.05）。可见，黄连解毒液能改善皮肤组织中的炎症细胞浸润，降低大鼠皮肤组织中EGF、VEGF、bFGF、TGF-β、PDGF 的表达，提高放射性皮炎创面的愈合率。