水飞蓟素通过共同抑制TLR4/NF-κB和TNF-α/ROS/P38MAPK通路减轻糖尿病肾病大鼠肾脏损伤的研究〔1〕

陈祎,杨太旺,王明生

(1.九江市第一人民医院,江西 九江 332000;2.九江市中医医院,江西 九江 332002)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见并发症,且伴随着我国人口老龄化的加剧,糖尿病患者的日益增多,DN的发病率也逐年增加[1]。DN病理特征以肾小球滤过率增加、基底膜和系膜增厚以及晚期的肾小球硬化和肾小管纤维化为主,是终末期肾脏疾病的主要原因之一[2-4]。研究证实[5],持续的高血糖会导致活性氧簇的过度产生和炎症介质的激活,引起氧化应激损伤,进而导致糖尿病患者的血管和肾脏受损。目前,由于氧化应激发生的相关通路复杂且靶点较多,所以DN发病的氧化应激机制仍未阐明。天然黄酮木脂素类化合物水飞蓟素是从菊科药用植物水飞蓟中提取出来的一种生物活性的物质。研究表明[6],水飞蓟素具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗病毒和抗肿瘤等作用。目前,国内外对于药用植物对肾脏的保护作用给予了更多关注。研究表明[7]水飞蓟素对糖尿病和抗肾小管间质纤维化和肾小球硬化也有预防和治疗作用。本研究拟采用链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠动物模型探讨水飞蓟素通过共同抑制Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)和肿瘤坏死因子/活性氧簇/p38丝裂原活化蛋白激酶(TNF-α/ROS/P38MAPK)通路减轻糖尿病肾病大鼠肾脏损伤的机制,为治疗DN提供新思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

链脲佐菌素(美国Sigma公司)、柠檬酸盐缓冲液(福建飞净)、水飞蓟素(上海安博)、磷酸盐缓冲液(PBS)(HyClone公司)、AU640型全自动生化分析仪(Ltd公司)、F6/10型匀浆机(上海净信)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒(南京建成)、引物(Sangon公司)。

1.2 STZ诱导糖尿病大鼠模型的建立及分组

健康SD大鼠50 只,雌雄各25 只,8～12 周龄,体质量170～200 g。无特定病原体(SPF)级环境,光照、室温、湿度符合要求,自由饮水,进食标准普通饲料,收集尿液检测尿蛋白阴性,在九江学院实验动物中心饲养,动物福利和实验程序均符合实验动物伦理标准。

将50 只大鼠按随机数字表法随机分为建模组40 只和对照组10 只。建模组大鼠在隔夜禁食后给予高脂饲料喂养4 周后,通过腹腔注射溶于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)中新鲜制备的STZ(30 mg/kg)诱发糖尿病,对照组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸盐缓冲液。4 周后测24 h尿白蛋白排泄率>20 mg且尿糖阳性提示糖尿病肾病建模成功。建模成功后将建模大鼠40 只按随机数字表法分为模型组、低剂量水飞蓟素组、中剂量水飞蓟素组及高剂量水飞蓟素组,每组10 只,分别用0,100,300,900 μg/kg水飞蓟素治疗8 周。所有动物均按照实验室指南进行养殖。

1.3 生化分析

治疗结束后24 h采集尾静脉血,利用全自动生化分析仪测定各组大鼠空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、胱抑素C(Cys-C)、β2微球蛋白(β2-MG)水平。收集24 h大鼠尿液,测定24 h尿蛋白(UTP)。

1.4 肾脏指数

腹腔注射麻醉,于冰上迅速摘取大鼠双侧肾脏组织,以预冷的PBS清洗干净后,用滤纸吸干、称重,计算肾脏指数。肾脏指数=双肾重之和(mg)/体质量(g)。

1.5 氧化应激指标测定

根据重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例,称取大鼠肾皮质剪碎,放入匀浆机,加入相应量的生理盐水或PBS,匀浆机30 HZ×1 min×3 次进行匀浆后用高速离心机12 000 r/min离心10 min,取上清分装,参照试剂盒说明书测定反映氧化应激水平的MDA,T-AOC等氧化应激指标。

1.6 RT-PCR检测信号通路相关mRNA

测定TLR4,NF-κB,TNF-α和P38MAPK等mRNA的表达:Trizol法提取肾脏组织中RNA,应用反转录试剂盒进行互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成,按比例加入cDNA、引物和染料,95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s循环40 次扩增,采用2-ΔΔCt方程计算目的基因的相对表达量[7]。mRNA的数量用内部参照标准化。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 水飞蓟素对各组大鼠体质量及肾脏指数的影响

低、中、高水飞蓟素组体质量均低于对照组,均高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05);低、中、高水飞蓟素组肾脏指数均高于对照组,均低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠体质量及肾脏指数比较

2.2 水飞蓟素对各组大鼠血糖及肾脏功能的影响

模型组及低、中、高剂量水飞蓟素组FBG,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组及低、中剂量水飞蓟素组Scr,BUN水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),高剂量水飞蓟素组Scr,BUN水平均高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05);低、中、高剂量水飞蓟素组FBG,Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2 各组血糖及肾脏功能比较

2.3 水飞蓟素对各组大鼠氧化应激指标影响

模型组及低、中、高剂量水飞蓟素组MDA水平均高于对照组,T-AOC水平均低于对照组(P<0.05);低、中、高剂量水飞蓟素组MDA水平均低于模型组(P<0.05),T-AOC水平均高于模型组(P<0.05)(见表3)。

表3 各组大鼠氧化应激指标的比较

2.4 水飞蓟素对各组大鼠肾组织中mRNA表达水平的影响

模型组及低、中、高剂量水飞蓟素组NF-κB p65 mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05);低、中、高剂量水飞蓟素组NF-κB p65 mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05);模型组及低、中剂量水飞蓟素组TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05),高剂量水飞蓟素组TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表达水平高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05);低、中、高剂量水飞蓟素组TLR4,TNF-α,P38MAPK mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05)(见表4)。

表4 各组大鼠肾组织中mRNA的表达水平比较

3 讨 论

肾素-血管紧张素-醛固酮系统、遗传因素和炎症是参与DN发展的重要原因。目前临床治疗手段主要为早中期采用控制饮食、降糖药、血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂等药物进行治疗,晚期治疗方式为肾脏替代治疗[8]。但目前的治疗手段都不能改善终末期肾病患者的肾脏状况,其生活质量往往较差。水飞蓟素是一种类黄酮化合物,具有免疫调节、改善氧化应激等作用。Sheela等[9]利用STZ和烟酰胺诱导制备了DN大鼠模型,接受水飞蓟素治疗大鼠的血糖、糖化血红蛋白和尿白蛋白水平显著降低,组织病理学评估显示病理损伤减少。有研究表明[10],水飞蓟素可以降低糖尿病肾病患者尿蛋白,改善肾脏损伤,是糖尿病肾病潜在的治疗药物。但有关水飞蓟素对DN氧化应激影响的作用机制研究较少。本研究采用STZ诱导糖尿病肾病大鼠动物模型,将大鼠分为模型组、低剂量水飞蓟素组、中剂量水飞蓟素组及高剂量水飞蓟素组,观察水飞蓟素对通过共同抑制TLR4/NF-κB和TNF-α/ROS/P38MAPK信号通路,减轻糖尿病肾病大鼠肾脏损伤的机制,以期为治疗DN提供新思路。Scr,BUN是临床评价肾功能损伤的常规指标。近年来研究表明[11-12],Cys-C,β2-MG在肾小球滤过功能下降早期即可变化,是反映肾小球滤过率的理想指标。张玉梅等[13]研究发现,Hcy,Cys-C,β2-MG水平与DN的进展密切相关。本研究中模型组大鼠Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平明显高于对照组,不同剂量水飞蓟素治疗大鼠的Scr,BUN,Hcy,Cys-C,β2-MG,24 h UTP水平均低于模型组,并呈现一定的浓度依赖性,表明水飞蓟素可明显减轻DN大鼠的肾脏损伤。TLR4/NF-κB通路是介导炎症反应的关键信号通路,TLR4能诱导NF-κB活性增加,NF-κB被激活后可刺激黏附分子和促炎因子的表达,同时TNF-α可在DN中特异表达,产生大量氧自由基,导致肾脏结构受损[14]。过量的ROS导致的氧化应激是DN发生的重要机制[15]。P38MAPK也可影响DN的进展[16]。本研究中,模型组大鼠TLR4,NF-κB p65,TNF-α,P38MAPK mRNA表达及MDA水平明显高于对照组,不同剂量水飞蓟素组大鼠TLR4,NF-κB p65,TNF-α,P38MAPK mRNA表达及MDA水平均低于模型组,T-AOC水平高于模型组并呈一定程度的浓度依赖性,提示水飞蓟素可调控TLR4/NF-κB和TNF-α/ROS/P38MAPK通路,可通过抑制其激活减轻氧化应激,进而减轻DN大鼠的肾脏损伤。

本研究的证据效力还存在一定不足,后续还需通过激活和抑制该通路进行对照验证,进而对水飞蓟素治疗DN的药理机制进行更全面明确的阐释。