竹叶黄酮提取纯化及其在轻工业中的应用研究进展

李翱翔 赵一鹤

(1 西南林业大学材料与化学工程学院 昆明 650224； 2 云南省林业和草原科学院 昆明 650201)

竹叶作为一种可食用和药用的植物资源， 在中国乃至其他国家都有着悠久的历史记录。 竹叶提取物具有多种生理活性， 对于保护人体健康具有重要作用[1]， 1998 年中国卫生部认定竹叶是一种草药。

竹叶中富含黄酮类化合物， 该类化合物也是植物中最重要的次生代谢产物之一[2]。 文献分析显示， 现已发现竹叶中有21 种黄酮类化合物， 主要以糖苷的形式存在于竹叶中， 分为O 苷和C 苷2 种， 并以黄酮C 苷为主[3]。 黄酮C 苷主要有4种活性化合物[4]。 魏琦等[5]通过高效液相色谱法同时测定竹叶中的13 种黄酮类化合物， 并用同样方法与牡竹属10 个竹种的竹叶黄酮类化合物进行比较， 结果发现不同竹种竹叶黄酮类化合物组成和含量存在差异； 李翱翔等[6]采用4 种黄酮碳苷标品分析了5 种竹叶的黄酮类成分及含量[6]， 印证了该结果。 已有研究表明， 黄酮类化合物表现出一系列生物活性， 包括抗氧化[7]、 抗真菌活性[8]、 调节血脂血糖和抑制肿瘤活性[9]、 阻断亚硝化反应、 消除溃疡以及降低患动脉粥样硬化、老年痴呆症、 帕金森综合征病的风险[10]等。 竹叶中提取的黄酮类化合物由于其独特的生物理化活性， 可用于医药产品、 功能保健产品以及日用化妆品， 也可进一步制成抗氧化剂、 抑菌防腐剂、天然营养性低甜度甜味剂等食品添加剂。 然而，到目前为止竹叶黄酮在轻工业上的应用并未取得实质性进展。 本文综述了国内外竹叶黄酮提取和纯化方法以及在轻工业领域的应用现状， 以期为竹叶黄酮工业化开发利用提供依据和参考。

1 竹叶黄酮类化合物的提取方法

常见的竹叶黄酮类化合物提取方法有煎煮法、共沉淀法、 超临界流体萃取法(SPE)、 表面活性剂法、 微波辅助提取法(MAE)、 双水相法、 超声波萃取法、 离子液体提取法、 生物酶解提取法、闪蒸提取法等， 根据提取原理可将这些方法归纳为化学提取法、 生物提取法、 物理提取法以及联合提取法4 类[11]。

1.1 化学提取法

化学提取法是将竹叶原料进行粉碎过筛后，选择合适的溶剂在最佳的提取工艺下进行提取的方法。 常用的溶剂为水或有机溶剂， 即选择黄酮类化合物和非目标物质之间具有极性差异的有机溶剂(例如常用的有丙酮、 乙醇、 甲醇、 乙酸乙酯及某些极性较大的混合有机溶剂) 进行提取。何春雷等[12]采用水提取法分析了10 个不同竹种的竹叶黄酮， 其最佳提取工艺条件为: 固液比1 ∶20、 提取温度80 ℃ (水浴加热)、 提取时间30 min。 水提取法具有经济环保、 设备简单、 工业生产成本低的优点， 但提取率较低， 也会附带多种水溶性杂质， 给分离纯化带来一定困难， 得到的产物含量少。 李坤平等[13]使用不同的有机溶剂对竹叶黄酮进行提取， 认为酒精为最合适的提取溶剂。 有机溶剂提取法便于操作、 经济适用、得率较高、 易处理， 相对于水提法更加常用， 但工业化生产耗量较大， 相对于水来说， 有机溶剂存在环境污染和回收困难等问题。 Wang 等[14]开发了以离子液体为溶剂提取竹叶黄酮的方法， 提出的最佳工艺条件为1.5 mol/L [BMIM] Br 水溶液、 固液比1 ∶41。

1.2 生物提取法

生物提取法主要是酶解法， 即利用酶来分解植物细胞壁和果胶质等， 加快提取溶剂进入细胞内部， 从而提高目标化合物的提取率。 赵洪等[15]利用纤维素酶提取竹叶黄酮， 最佳提取工艺为:酶添加量0.5%， 提取温度45 ℃， 固液比15 倍，提取时间1.5 h、 pH 值为5。 罗春连[16]在赵洪等的基础上加入了一定比例的果胶酶， 用2 种混合酶优化提取工艺， 得到的最佳工艺条件为:0.05%的果胶酶、 0.08%的纤维素酶， 固液比1 ∶20， 酶解温度48 ℃， 酶解时间2 h， pH 值为5； 在该条件下提取效果最佳， 总黄酮的提取率可以达到85%～95%， 比传统提取法的提取率提高了10%左右。

采用酶解法提取竹叶黄酮所应用到的设备较为简易， 工艺简单， 操作简便， 成本低廉， 效率高， 而且相对有机溶剂提取更加环保安全。

1.3 物理提取法

物理提取法主要是借助外力作用创造出高温、高压、 高频等提取条件， 从而获取竹叶黄酮的方法。 物理提取方法主要有超临界流体法、 破碎提取法等。 陶清等[17]利用超临界流体CO2萃取技术进一步优化竹叶黄酮的提取工艺， 得到的最优提取条件为: 萃取压力40 Mpa、 夹带剂用量1 mL/g、萃取温度60 ℃、 萃取时间60 min， 最终的竹叶总黄酮提取量为4.978 mg/g。

与化学提取方法相比， 物理提取法不仅提高了目标产物的得率， 而且节能省时。

1.4 联合提取法

联合提取法就是将几种提取方法相结合进行提取竹叶黄酮。 李烨等[18]利用响应面法优化超声波提取竹叶黄酮， 最佳工艺条件为: 70%乙醇，超声功率190 kW， 超声时间30 min； 在该条件下竹叶黄酮提取率为5.463%。 许子竞[19]以毛竹叶为原料， 通过响应面法优化微波提取毛竹叶黄酮的工艺， 在固定微波功率3.0 kW 和以80%乙醇为溶剂条件下提取竹叶黄酮， 得出最佳提取工艺为: 固液比1 ∶24 (g ∶mL)， 在81 ℃条件下提取21 min， 黄酮的提取率为5.78%。 王博文等[20]应用Design-Expert 法得到提取的最优条件下(80%乙醇溶液作为溶剂， 固液比1 ∶17、 提取温度82 ℃、 提取时间86 min、 氧化石墨烯加入量为1.5 mg/g) 竹叶黄酮的提取率可达88.4%， 相比只用乙醇回流提取提高约10.6%。 此外， 联合提取法还有表面活性剂辅助超声提取法[21]、 超声波辅助双水相提取法[22]、 超声-微波协同辅助酶提取法[23]等都应用在黄酮类化合物的提取上， 但这些方法尚未应用在竹叶黄酮的提取上， 将来可能成为竹叶黄酮一种比较理想的提取方法。

2 竹叶黄酮类化合物的纯化和含量测定方法

黄酮类化合物分离的传统方法主要有配位反应法[24]、 溶剂萃取法[25]、 醇沉法[26]等， 最近较为先进的技术主要有高速逆流色谱技术(HSCCC)、 分子印迹技术(MIT)、 液滴逆流色谱技术(DCCC)， 以及较早方法中的压液相色谱法(MPLC)、 循环液相色谱技术(CLC) 和离心制备薄层色谱法(CPTLC)。 目前， 应用在竹叶黄酮的纯化分离的方法主要有聚酰胺柱层析法、 大孔径树脂吸附法、 硅胶柱层析法以及超滤膜法4种。 根据各方法的理化性质可归为3 类: 柱层析法、 大孔树脂吸附法以及超滤膜法。

2.1 竹叶黄酮类化合物的纯化方法

2.1.1 柱层析法

可采用聚酰胺柱层析法、 硅胶柱层析法等方法。 郭雪峰等[27]通过对比6 种纯化工艺， 认为聚酰胺柱吸附法为最佳工艺， 纯化后竹叶黄酮浓度可达0.59～0.60 mg/mL。 张春娟等[28]对比3 种聚酰胺树脂的纯化效果， 发现竹叶黄酮的4 种黄酮碳苷在聚酰胺纯化后在竹叶黄酮粗品中纯度达76.939 mg/g， 以选择60 ～100 目的聚酰胺树脂效果最佳。 孙武兴等[29]采用薄层色谱法、 反向色谱柱(ODS) 法等方法进行分离纯化竹叶提取化合物， 效果良好。 郭雪峰等在用有机溶剂提取竹叶黄酮粗产物之后， 先用硅胶柱进行一次纯化， 用Sephadex LH-20 凝胶柱和RP-18 反相硅胶柱进行二次纯化分离， 发现硅胶柱层析法操作复杂耗时长， 而且硅胶的吸附性较大， 对黄酮分离效果较差。

2.1.2 大孔树脂吸附法

姚林娜等[30]采用AB-8 大孔树脂吸附法对竹叶黄酮粗品进行纯化， 并确定了最佳工艺条件，纯化后竹叶黄酮纯度比纯化前约提高2.7 倍。 周建飞等[31]对比了8 种大孔径树脂对竹叶黄酮的静态吸附与解吸效果， 筛选出2 种较好的树脂D101-1 和AB-8， 并采用混用技术进行分离纯化竹叶黄酮， 分离纯化效果得到较好提升， 样品中黄酮纯度在原有的基础上提升了19.7%。 由于竹叶黄酮碳苷极性较大， 与其他纯化方法相比， 大孔树脂吸附法的纯化效果并非特别理想， 可以结合其他的纯化方法进行二次纯化。

2.1.3 超滤膜法

近年来， 作为现代药物纯化工业中取代传统分离法的重要方法， 超滤(UF) 膜分离被应用于分离植物提取物中的不同组分， 该方法具有操作简便、 在常温常压即可进行、 不需要剧烈反应条件等优点， 但存在膜污染的问题。 唐浩国等[32]用5 种常见的超滤膜对麻竹叶黄酮进行纯化， 从中选择出了分离纯化效果较好的聚砜纤维膜PSF-500， 得到的竹叶黄酮的纯度达到44.132%。 王文渊等[33]利用微滤-超滤二级膜联用分离技术对竹叶黄酮提取液进行处理， 去除部分杂质后竹叶黄酮纯度达到41.61%， 竹叶黄酮回收率超过91%。

2.2 竹叶黄酮含量测定方法

2.2.1 分光光度法

分光光度法具有灵敏度高、 快速、 便于操作等优点， 是目前竹叶黄酮成分测定最常用的方法，但由于竹叶黄酮粗提取液中杂质的存在， 使得最终测定值偏高， 因此应先分离出杂质再利用分光光度法测定竹叶黄酮成分含量， 以获得较为理想的测定结果。 该方法的基本原理是黄酮类物质的基本结构上都有酚羟基或还原性羰基， 这些基团能够与金属盐离子形成有色络合物， 从而在特定的紫外波长下具有一定的吸光度。 池玉梅等[34]通过亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法和氯化铝-乙酸钾法比较了12 种黄酮类化合物的紫外和可见光谱， 分析了分光光度法对于测定黄酮类化合物的适用性， 结果认为该方法只适用于部分黄酮类成分分析。

2.2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱(HPLC) 是生物化学、 药理学和环境科学等各个研究领域中应用最广泛的分析方法之一。 一些学者采用HPLC-外标法测定了4 种丛生竹中总黄酮[35]。 张春娟等[28]采用高效液相色谱法结合紫外光谱法， 同时测定了4 种竹叶黄酮碳苷， 测得的结果分别为荭草苷13.73 mg/g、异荭草苷49.68 mg/g、 牡荆素7.85 mg/g 和异牡荆素30.70 mg/g。 高效液相色谱也可与其他技术联用， 如Gao 等[36]采用高效液相色谱法与二极管阵列检测技术和离子交换技术相结合， 以高效液相色谱仪为基础， 从猪笼草中提取了14 种黄酮类化合物。

3 竹叶黄酮在轻工业中的应用

竹叶黄酮由于具有多种生物学活性如抗氧化、抗肿瘤活性、 抗辐射、 抗病毒、 提高免疫力、 抑菌抗炎等而日益受到关注， 被广泛应用于食品、医药、 日化产品以及其他轻工业领域中。

1) 在功能食品中的应用。 目前， 与竹叶相关的各种类型用于增强免疫力、 清热解毒的药品及保健品等系列功能产品(如片剂、 口服饮品、 胶囊等) 已经上市。 例如， 浙江大学张英教授带头研制成功了竹叶黄酮类产品 (竹康宁胶囊)，2002 年新时代集团在原有基础上进行技术改进研制出片剂型竹康宁产品， 该产品在当年被国家卫生部批准为国产保健品。 竹啤是在啤酒中加入一定量的竹叶黄酮， 添加剂量在100 mg/L 以上， 这种啤酒不仅具有独特的竹叶清香， 还具有增强免疫力、 缓解疲劳、 清除体内过氧化物、 降低酒精对肝脏的伤害、 促进新陈代谢和降低血糖血脂等得功效[37]。

2) 在天然药物开发中的应用。 早在汉代的《神农本草经》 中竹叶就被作为一味中草药， 具有清热解毒、 轻身益气的功效。 30 多年前， 日本学者福山伍郎研究发现， 屋久岛竹叶提取物对细胞产生的赘生物细胞群(肿瘤) 具有良好的抑制作用[38]。 也有学者研究了竹叶提取物的药理学作用， 并将其应用在治疗癌症上， 取得了良好效果。随着医疗科技的进步和人们对天然药物的需求，竹叶黄酮作为新生代天然化学产物将是未来的一大研究方向。 郑州大学第一附属医院王兆斌[39]等通过体外、 体内和动物模型以及药理实验， 研究了竹叶黄酮在心脑血管诊断中的作用， 研究发现竹叶黄酮对防止脑缺血有一定的作用。 竹叶黄酮有潜力成为预防心脑血管疾病的天然药物。

3) 在日化产品中的应用。 竹叶黄酮可以清除自由基、 抗辐射、 抑菌和抑制酪氨酸酶活性， 加快细胞的新陈代谢， 延缓表皮组织细胞衰老， 将自由基对人体细胞的伤害降到最低； 另外， 皮肤上的色素沉着主要是因为酪氨酸酶会促进酪氨酸转化为多巴色素， 经一系列转化变为黑色素， 竹叶黄酮抑制酪氨酸酶活性， 可以达到美白皮肤等效果。 Lu 等[40]研究表明竹叶黄酮在皮肤上使用时不会刺激人体的粘膜和皮肤， 绿色安全， 无任何毒副作用， 因此可以将竹叶黄酮抗衰老、 抗氧化等功能性因子作为一种添加剂应用在护手霜和防晒霜等日化产品中， 达到实物化利用。

4) 在其他方面的应用。 竹叶黄酮作为一种具有多重生理功效的新型天然活性物质， 也可应用在畜牧养殖业和农业生产中， 杨仕群等[41]对竹叶黄酮在养殖业中的应用做了较为详细的阐述。 张运红等[42]以液体溶剂的形式对辣椒幼苗喷洒一定浓度的竹叶黄酮水溶液， 发现在辣椒发育过程中竹叶黄酮能提高辣椒的抗寒性并促进辣椒的生长。

4 竹叶黄酮工业化利用的发展趋势

竹叶黄酮类化合物具有独特的生物活性， 在很多行业领域都有较好的应用前景， 因此竹叶黄酮的研究开发一直都是学术界关注的热点。 然而，在相关研究领域还存在许多尚待解决的问题， 比如竹叶黄酮类化合物的提取率较低， 含量测定方法不完善和应用难以领域产业化等。 下一步研究的重点和方向应是:

一是联合提取法或者不同方法协同使用。 目前提取和纯化分离竹叶黄酮的各种方法各有利弊，可结合各类方法的优点组合成更多的联合提取法或是不同方法协同使用， 筛选出更优、 更适合的提取和纯化分离的方法， 并应用现代提取、 分离新工艺进行竹叶黄酮等活性成分的提取和精制，提高竹叶黄酮提取得率和质量， 增强产品的生物活性和生理功能， 减少杂质和无效成分的副作用。

二是建立高效、 准确测定竹叶黄酮类化合物含量的方法。 目前竹叶黄酮的测定方法一般采用比色法或液相色谱法， 比色法更为普遍， 经过改进后的比色法能克服一些常规比色法的弊端， 测量结果与HPLC 法相当， 但目前还没见到改进比色法和HPLC 法二者比较的报道。

三是竹叶黄酮工业化和规模化生产应用。 竹叶黄酮类化合物具有优良的清除氧自由基、 降低血脂、 抑制细菌生长繁殖、 降低表皮组织细胞老化速度和降低心肌缺血风险等功效， 为科研工作者提供了丰富的想象空间， 也为竹叶黄酮类化合物应用于保健食品功能因子、 膳食补充剂和天然药物的开发及功能定位提供了独到的着力点。 虽然国内外已经有大量关于竹叶黄酮提取方法的研究成果， 但是这些成果存在一定的局限性， 还无法实现工业量产化应用， 未能将其应用到民生领域。 如何快速、 高效地将竹叶黄酮产业化和规模化也将是下一步研究的重点。