锦鲤皮肤中类胡萝卜素和蝶啶色素总量的测定方法

王春波，田 雪＊

（河南师范大学水产学院，河南 新乡 453007）

体色是长期自然选择的结果，并在动物的集群行为、繁殖、获利、回避和识别等方面发挥重要作用[1]。随着研究的不断深入，人们对体色合成的主要调控机制及其相关信号通路有了更加深刻的认识。在脊椎动物中，除黑色素合成信号通路和蝶啶通路的研究外，类胡萝卜素对动物体色的影响也受到人们越来越多的关注[2]。家蚕、鸟类和爬行动物的研究证实，动物体表的红色（包括橙色、黄色等渐变色）主要由类胡萝卜素、蝶啶色素单独或共同决定。鱼类体表的红色色素主要包括类胡萝卜素和蝶啶色素，二者均可产生红色、粉色、橙色、黄色和白色等一系列颜色[3]。类胡萝卜素普遍存在于水产动物皮肤、鳍条、鳞片、肌肉以及肝脏中，是鱼类体色和肌肉颜色的主要物质基础，在动物的择偶、交流、抗氧化等过程中具有重要作用[4]。蝶啶代谢通路调控蝶啶色素合成，在生物体内发挥着重要作用。鱼类中，蝶啶代谢通路以三磷酸鸟苷(GTP) 为底物，通过GTP环化水解酶(GTP cyclohydrolase，GCH)、6-丙酮酰四氢蝶呤合酶（6-PTPS）和墨蝶呤还原酶（SPR）等一系列酶促反应，最终合成黄色或橙红的蝶啶类色素，从而参与鱼类体色的形成[5]。

锦鲤 （Cyprinus carpio L.）属鲤形目(Cypriniformes)、鲤科（Cyprinidae）、鲤属（Cyprinus），是风靡当今世界的一种体型较大的观赏鱼类，有“水中活宝石”“会游泳的艺术品”的美称，具有很高的经济和饲养价值。锦鲤现有纯红、纯白、红白、大正三色和昭和三色等十三大品系，体色丰富，图案千变万化，是鱼类体色研究的良好材料[6]。现今，关于鲤科鱼类种属间系统进化关系和锦鲤遗传多样性的研究较多，但对于锦鲤皮肤色素成分的研究较少[7]。因此，本文以纯红和纯白锦鲤为材料，对锦鲤皮肤色素成分进行鉴定与分析，旨在探讨锦鲤色素组成与体色的关系，为锦鲤体色的遗传变异研究提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用锦鲤来自河南师范大学水产学院培育的F3纯红和纯白锦鲤家系。丁香酚麻醉后，对纯红和纯白锦鲤侧线鳞上方和下方带鳞片的皮肤组织进行取样，随后放入液氮中速冻，放于-80℃冰箱保存。

1.2 锦鲤体表组织中类胡萝卜素和蝶啶色素的提取

总类胡萝卜素和蝶啶色素提取方法如下：取1 g左右锦鲤带鳞片的皮肤组织，放入2 ml EP管中，充分剪碎后加入1 ml丙酮。研磨均匀后，4℃8000 rpm/min离心5 min收集上清，重复上述过程三次，收集上清，氮吹仪吹干后，1 ml正己烷溶液重新溶解后测定吸光值。总类胡萝卜素的测定波长为447 nm，空白对照组为正己烷溶液，消光系数为2500。向提取后的皮肤残留物中加入1.5 ml pH=2.0的30%酸化乙醇，间歇研磨1 h，4℃8000 rpm/min离心5 min收集上清测定吸光值。该方法提取的蝶啶色素为蝶呤色素1。蝶啶色素的测定波长为490 nm，空白对照组为pH=2.0的30%酸化乙醇溶液，消光系数为25100。

叶黄素和蝶啶色素提取方法如下：取1 g左右锦鲤带鳞片的皮肤组织，放入2 ml EP管中，充分剪碎后加入1 ml甲基叔丁基醚（MTBE），研磨均匀后4 ℃8000 rpm/min离心5 min，重复上述步骤四次。收集上清，氮吹仪吹干后，加入1 ml MTBE重新溶解，酶标仪测定吸光值，该方法提取的类胡萝卜素主要是叶黄素。叶黄素的测定波长为447 nm，空白对照组为MTBE，消光系数为2550。向提取后的皮肤残留物中加 入1 ml 1%的NH4OH 溶 液，研 磨2 min，4℃，8000 rpm/min离心5 min，重复该步骤一次。收集上清测定吸光值。该方法提取的蝶啶色素主要为蝶呤色素2，测定波长为490 nm，空白对照组为1%的NH4OH溶液，消光系数为10000。

按如下公式计算提取的相关色素含量：C (mg/kg) =A×K×V /(E×G)

其中C为类胡萝卜素或蝶啶色素含量（mg/kg），A为吸光值，K为常数，V为提取液体积 （ml），E为摩尔消光系数，G为样品重量（g）。

1.3 数据处理

SPSS 16.0进行One-Way ANOVA方法的LSD和Duncan氏比较，结果用平均值±标准误(mean ± SE)表示，P＜0.05代表显著相关性。

2 结果

2.1 纯红、纯白锦鲤侧线鳞上方皮肤组织中类胡萝卜素和蝶啶色素含量

如图1所示，纯红锦鲤侧线鳞上方体表组织中总类胡萝卜素（0.264±0.073 mg/kg）和叶黄素（0.494±0.073 mg/kg）的含量均显著高于纯白锦鲤侧线鳞上方体表组织的总类胡萝卜素（0.130±0.015 mg/kg）和叶黄素（0.161±0.014 mg/kg）的含量（P＜0.05）。果蝇蝶呤1在纯红和纯白锦鲤侧线鳞下方皮肤组织的含量分别为（0.015±0.002 mg/kg）和（0.015±0.002 mg/kg），果蝇蝶呤2在纯红和纯白锦鲤侧线鳞下方皮肤组织的 含 量 分 别 为 （0.091±0.002）mg/kg 和 （0.087±0.006 mg/kg），这两种方法提取的蝶啶色素在两种体色间没有显著差异（P＞0.05）。

图1 纯红和纯白锦鲤侧线鳞上方皮肤组织总类胡萝卜素、叶黄素和蝶啶色素的含量比较

2.2 纯红、纯白锦鲤侧线鳞下方皮肤组织中类胡萝卜素和蝶啶色素含量

如图2所示，纯红锦鲤侧线鳞下方皮肤组织中总类胡萝卜素 （0.354±0.075 mg/kg）、叶黄素 （0.596±0.131 mg/kg）和果蝇蝶呤2（0.126±0.004mg/kg）的含量均显著高于纯白锦鲤侧线鳞下方皮肤组织的总类胡萝卜素（0.088±0.004 mg/kg）、叶黄素（0.172±0.050 mg/kg）和果蝇蝶呤2（0.076±0.010 mg/kg）的含量（P＜0.05）。果蝇蝶呤1在纯红和纯白锦鲤侧线鳞下方皮肤组织的含量分别为（0.026±0.007 mg/kg）和（0.024±0.003 mg/kg），在两种体色间没有显著差异（P＞0.05）。

图2 纯红和纯白锦鲤侧线鳞下方皮肤组织总类胡萝卜素、叶黄素和蝶啶色素的含量比较

3 讨论

蝶啶是一种动物色素的总称，是由嘧啶和吡嗪环组成的芳香化合物[8]。蝶啶色素可由动物自身合成，可分为有色蝶啶与无色蝶啶。有色蝶啶包括墨蝶呤和果蝇蝶呤，其中墨蝶呤显黄色，果蝇蝶呤显红色；而无色蝶啶为生物蝶呤[5]。正常黑腹果蝇眼色为红褐色，由红色的果蝇蝶呤和褐色的眼黄素2种色素构成[10]。大多数蜥蜴的橙色/红色体色也来自蝶啶色素[11]。

相对于蜥蜴等物种，大多数养殖鱼类的体色主要源于类胡萝卜素[3]。与蝶啶色素不同，鱼类自身不能合成类胡萝卜素，必须通过外源摄取。由于不同鱼类对类胡萝卜素的代谢能力不同，体内起主要作用的类胡萝卜素种类也具有一定的差异。锦鲤、金鱼和红鲤等大多数淡水鱼，可将类胡萝卜素（黄体素、玉米黄质等）转化形成虾青素；而鲑鳟鱼类缺乏对黄体素和玉米黄质等类胡萝卜素的转化能力，可直接将类胡萝卜素储存在体内[12]。目前，饲料添加含天然或人工合成的类胡萝卜素改善鱼类体色已成为水产动物营养学研究的热点。在饲料中添加富含红色类胡萝卜素的红辣椒粉，可增强锦鲤体表着色、促进生长[13]。此外，光照条件也能够影响锦鲤体内类胡萝卜素的分布，暗光条件下锦鲤皮肤和肌肉的类胡萝卜素含量显著低于亮光条件[14]。

目前，对鱼类体表组织色素成分和含量的鉴定方法主要为分光光度计法、薄层色谱法和高效液相色谱法。关于蝶啶色素含量鉴定的报道较少。本实验通过分光光度计法分别对纯红和纯白锦鲤皮肤组织中不同区域的类胡萝卜素和蝶啶色素含量进行鉴定。结果发现，纯红和纯白锦鲤侧线鳞上、下方皮肤组织中的色素差异主要以类胡萝卜素为主，蝶啶色素在纯红和纯白锦鲤侧线鳞上方皮肤组织中无明显差异，只有果蝇蝶呤2在纯红锦鲤侧线鳞下方皮肤组织显著高于纯白锦鲤。以上结果可能说明类胡萝卜素和果蝇蝶呤2可能是造成锦鲤红、白体色差异的关键色素成分。但具体是哪些类胡萝卜素参与锦鲤体色的形成仍有待更加深入的研究和探索。