中医药联合EGFR-TKIs 治疗NSCLC 耐药的分子机制及研究进展

桑舒柳 姜靖洁 龚亚斌 （上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肿瘤科 上海 200437）

据统计，肺癌发病率和死亡率稳定下降［1］，但是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）5 年生存率仅约为25%，部分符合条件的患者在接受免疫治疗或靶向治疗后生存时间获得延长［2］。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）在敏感突变NSCLC 治疗中效果显著。然而，几乎所有的患者在接受EGFR-TKIs 治疗后12 个月内都会产生不同程度的耐药［3］。由于耐药的普遍性，延缓EGFR-TKIs 耐药并延长生存时间是研究的热点之一。中医药能通过多靶点多通路多途径延缓NSCLC 耐药，对NSCLC 耐药的研究具有极大的潜力。本文将从EGFR-TKIs 耐药机制及近5 年中医药联合EGFR-TKIs 治疗NSCLC 的基础和临床研究，并以吉非替尼和奥希替尼为例进行概述，为临床治疗NSCLC 提供参考。

1 NSCLC 的EGFR-TKIs 靶向治疗及耐药机制

EGFR-TKIs 能选择性结合EGFR 细胞内酪氨酸激酶域的ATP 结合位点，通过AKT﹑MAPK 的途径，阻断EGFR 分子内酪氨酸自身磷化及活化，抑制RAS/RAF/MAPK﹑PI3K-Akt 等下游信号通路，从而使肿瘤细胞凋亡［4］。第一代EGFR-TKIs 以吉非替尼﹑厄洛替尼等为代表，与酪氨酸激酶功能域竞争结合以抑制其磷酸化。第二代EGFR-TKIs，如阿法替尼﹑达克替尼等，是不可逆的酪氨酸抑制剂，能更好地改善患者的生存质量。此外，有报道发现，阿法替尼和达克替尼还对L861Q，G719X和S768I 等非常规突变有效［5］。前两代药物使用后，出现了以T790M 突变机制为主的耐药现象，于是以奥希替尼和罗西替尼为代表的第三代EGFRTKIs 应运而生。第三代EGFR-TKIs 可与酪氨酸激酶功能域不可逆地竞争结合，抑制其磷酸化，与二代药物相比，三代药物在对EGFR 突变和T790M突变敏感的同时可保留野生型EGFR 酪氨酸激酶。虽然第三代EGFR-TKIs 的中位客观缓解率达到了71%，中位无进展生存期达到10.1 个月，但其耐药仍无法避免［6］。如20 号外显子上的C797S 突变，这是一种具有交叉抗性的突变，因为它消除了奥希替尼与EGFR 的共价键。而在罗西替尼的治疗方案中，观察到E709K﹑L692V﹑C797S 和L798I的等位基因频率增加。其中L798I 突变，可能影响罗西替尼与EGFR 的C797 残基共价键的形成，而E709K 或L692V 突变的耐药机制尚不明确［7-8］。此外，第四代EGFR-TKIs 的研究也已经开展［9-10］。有学者将EGFR-TKIs 的耐药机制分为原发性耐药和继发性耐药［11］。原发性耐药的机制尚未形成统一认识，包括KARS 基因突变﹑BIM 缺失多态性和EGFR 20 外显子插入突变等［12-14］。继发性耐药除上文所述T790M 突变，C797S 突变和L798I 突变，小细胞肺癌转化等还有旁路信号通路的激活，如MET 扩增﹑HER2 基因扩增﹑PIK3CA 突变﹑KRAS 突变等［15-17］。

2 中医药治疗靶向药物耐药的研究进展

研究发现中医药联合化疗在NSCLC 治疗中具有减毒增效的作用［18-21］。许多研究表明中医药联合EGFR-TKIs 治疗晚期NSCLC 能延缓或逆转耐药。此外，中药可以多途径﹑多靶点治疗疾病，这可能是其发挥作用的关键。本文将从临床和实验机制方面对延缓或逆转NSCLC 耐药的中药活性单体及复方进行整理。

2.1 中医证候辨析

肺癌属于中医学“息贲”“肺积”“劳咳”等范畴，其病位在肺。《医宗必读》言“积之成也，正气不足，而后邪气居之”，靶向药物为中医所言“药毒”，具有温热之性，可耗伤人体气阴，长期应用可在一定程度上引起中医证型改变。张志怡［22］发现接受TKI 治疗后，中医证候分布以气虚（16.7%）﹑阴虚（16.7%）﹑痰湿（12.0%）为主要构成。李丹博等［23］发现经靶向治疗后的63 例原发性肺癌患者肺气阴两虚证增多（39.68%）。根据EGFR-TKIs 治疗后患者的证型分布情况，发现养阴益气是耐药后患者的主要调理手段。

2.2 中医临床辨证论治

延缓耐药时间是中医药的主要优势。生物医学文献数据库的1 项Meta 分析显示，中医药联合EGFR-TKIs 治疗的总有效率﹑生活质量改良率﹑1 年生存率等疗效指标均明显优于单用EGFRTKIs 治疗［24］。同时，在153 例EGFR 突变的晚期NSCLC 患者的研究中，中药联合EGFR-TKIs 能延长无进展生存期，增强治疗效果［25］。高瑞珂［26］对于中医药治疗晚期NSCLC 的90 例患者进行回顾性研究和统计分析后发现中医药延缓EGFR-TKIs耐药的核心治则主要是补肺健脾﹑化痰散结，佐以清热解毒。江冠铭等［27］将晚期 NSCLC 耐药患者60 例分为单药组（奥希替尼）和联合组（人参皂苷Rg 联合奥希替尼），发现联合组的PFS 为16 个月，高于单药组。王莹［28］发现联合组（益气固表丸联合靶向药物）与单用靶向药物相比，其PFS 更长。孙建立等［29］通过1 项随机对照临床研究发现养阴解毒颗粒联合EGFR-TKIs 治疗敏感突变的肺癌患者，其PFS 均优于单纯EGFR-TKIs 靶向治疗，延长约2.2 个月。研究说明中医药在临床治疗上对延长靶向药的耐药时间具有极大的潜力。

除了延缓耐药之外，中医药还能缓解EGFRTKIs 产生的不良反应，并增强治疗作用。EGFRTKIs 常见的不良反应有腹泻﹑皮疹等。1 项观察性研究对146 例前3 个月内接受EGFR-TKIs 治疗的非小细胞肺癌患者进行研究，发现其中93.2%的患者出现皮肤毒性反应［30］。彭姝蕾等［31］将80 例EGFR-TKIs 耐药的晚期NSCLC 患者分为对照组（GP 化疗）和联合组（GP+扶正消瘤方），结果联合组客观缓解率为26%，临床获益率为36%，均优于对照组，且消化道反应﹑毒副反应发生率均降低（P<0.05）。苏运［32］观察发现治疗组（消风散加味口服并外洗）改善EGFR-TKIs 相关性湿热型皮疹优于对照组（盐酸米诺环素胶囊口服配合红霉素软膏外用）。石红［33］通过前瞻性随机对照研究发现，经靶向治疗后引起腹泻的患者，试验组予中药腹泻方治疗，对照组予易蒙停治疗，2 周后对照组与试验组腹泻缓解率分别达到76.67%和81.82%。研究表明中医药具有减毒增效的作用。

3 中医药联合吉非替尼逆转NSCLC 耐药的机制研究

中医药联合吉非替尼能延缓或逆转靶向耐药，主要是通过干预使耐药细胞变敏感，抑制肿瘤生长，促凋亡，阻止肿瘤细胞侵袭和转移的机制，对EGFR-TKIs 具有协同作用。

3.1 抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡

肿瘤是以细胞增殖异常为特点的疾病，细胞凋亡是指在生理或病理条件下由基因控制的细胞自主有序死亡，抑制肿瘤细胞的增殖﹑促进肿瘤细胞凋亡是治疗NSCLC 耐药的关键。

3.1.1 中药单体 丘韶校等［34］发现葫芦素B 明显抑制PC-9/GR 细胞的增殖能力，并呈剂量依赖性，且降低 p-Jak2﹑p-STAT3 的表达，因此，推断葫芦素B 通过抑制STAT3 信号通路来诱导吉非替尼耐药NSCLC 的凋亡。Tang 等［35］发现柴胡皂苷-d（SSD）联合吉非替尼降低NSCLC 细胞增殖活力，诱导其细胞凋亡。此外，SSD 分别降低和提高了P-STAT3 和Bcl-2 的表达。下调STAT3后可促进肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。表明SSD 的抗肿瘤机制与抑制STAT3/Bcl-2 信号通路有关。Ming 等［36］发现海带主要活性成分岩藻黄质（FX）对吉非替尼耐药表型的肺癌细胞有明显的抑制作用，体内移植实验证实FX 可抑制肿瘤生长，增强肺癌细胞对吉非替尼的敏感性，其作用机制可能与抑制肿瘤细胞增殖和激活细胞凋亡有关。此外，有研究表明miR345 和miR498 在吉非替尼耐药的NSCLC 细胞中表达显著降低，白藜芦醇衍生物反式-3,5,4-三甲氧基二苯乙烯（TMS）联合吉非替尼能通过上调miR-345/498 提高NSCLC 细胞对吉非替尼的敏感性，诱导细胞凋亡，miR345和miR498 通过细胞周期阻滞抑制增殖，并通过直接靶向调控MAPK/c-Fos 和AKT/Bcl-2 信号通路，提示TMS 可能通过上调miR-345/498 而抑制MAPK/Akt/Bcl-2 通路，从而降低非小细胞肺癌对吉非替尼的耐药性［37］。

3.1.2 中药复方 高欣［38］通过体外实验发现康莱特注射液联合吉非替尼可明显抑制人肺腺癌H1299细胞增殖并诱导其凋亡，Western Blot 结果显示联合组Bcl-2 蛋白降低，Bax 蛋白上升，提示其作用机制可能与上调Bax 的蛋白表达水平，下调Bcl-2的蛋白水平有关。Pan 等［39］通过体外实验发现参芪扶正注射液（SFI）通过下调MAPK/SREBP1 通路对吉非替尼耐药细胞具有协同的抗增殖和促凋亡作用。Chen 等［40］发现养阴解毒汤联合吉非替尼组细胞凋亡率增加，且PI3K/Akt 下调。体内实验发现联合用药组抑制了肿瘤生长，TUNEL 染色阳性率高于吉非替尼单药组，同时PI3K/Akt 下调，表明养阴解毒汤可能通过下调PI3K/Akt 信号通路逆转吉非替尼耐药。

3.2 降低侵袭转移能力

侵袭转移是恶性肿瘤发生发展过程中的重要因素，降低肿瘤细胞侵袭转移能力是治疗NSCLC耐药的重要部分。

3.2.1 中药单体 陈琦等［41］通过体外实验发现榄香烯及肝细胞生长因子（HGF）联合吉非替尼显著抑制PC9 细胞的侵袭能力，Western Blot 结果显示联合组显著抑制p-Met 和p-AKT 的蛋白表达，表明榄香烯逆转吉非替尼耐药可能是通过抑制HGF 活化和影响c-MET 下游信号通路来实现的。詹建伟等［42］通过体外实验发现姜黄素联合吉非替尼可抑制HGF 诱导c-Met/AKT/mTOR 通路活化并逆转PC9 细胞的迁移和上皮间质转化。黄芪多糖可促进吉非替尼耐药细胞的凋亡，降低其增殖和迁移能力。此外，黄芪多糖可增加E-cadherin的表达，降低N-cadherin 和vientin 的表达，提示其逆转耐药机制可能与抑制PD-L1/SREBP-1/EMT信号通路有关［43］。

3.2.2 中药复方 蒋立峰等［44］研究发现清肺化瘀解毒方联合吉非替尼降低耐药细胞株A549/GR 的增殖能力，Western Blot 结果发现PI3K﹑AKT 蛋白表达量降低，qRT PCR 显示PI3K﹑AKT 的mRNA 相对表达量显著下降。表明清肺化瘀解毒方可能通过调控PI3K/AKT 信号通路逆转吉非替尼获得性耐药。研究结果表明许多中药单体能抑制癌细胞增殖和诱导其凋亡，证明了单药作为抗癌药物的潜力。相比之下，中药复方的研究较少，而且存在一些局限性，如大多机制研究仅体现了蛋白表达的水平，动物实验研究比较少，有待进一步研究。

4 中医药联合奥希替尼治疗NSCLC 耐药的机制研究

中医药联合奥希替尼延缓或逆转靶向耐药的研究较少，主要机制是抑制肿瘤生长﹑促凋亡﹑抑制癌细胞的干性。

Hu 等［45］发现紫草素联合AZD9291 可以增强wtEGFR NSCLC 细胞凋亡，而紫草素作为ROS诱导剂，ROS 抑制剂NAC 或GSH 可逆转紫草素联合AZD9291 诱导的细胞凋亡，说明紫草素联合AZD9291 的抗肿瘤活性与ROS 有关。Western-Blot发现联合组上调了ATF-4 和p-eif2α（ER -51）的表达，提示紫草素可能通过ROS 介导的内质网应激提高奥希替尼对wtEGFR NSCLC 细胞的敏感性。Zang 等［46］发现厚朴酚（HNK）联合奥希替尼使奥希替尼耐药细胞系增殖抑制率和细胞凋亡率明显升高，将Mcl-1 过表达后奥希替尼耐药细胞免受HNK 和奥西替尼联合治疗诱导的凋亡，而且联合用药对奥希替尼耐药异种移植瘤（包括具有19del，T790M 和C797S 三重突变的裸鼠）生长抑制更明显。说明厚朴酚能通过促进其降解而增强的Mcl-1 还原而增强耐药细胞系对奥希替尼的敏感性。Tang 等［47］发现人参皂苷Rg3 降低H1975/OR 细胞的干度，明显表现为降低了球形形成能力﹑干度标记物的表达和ALDH1 活性。RNA测序数据显示，Hippo 通路位于激活通路的顶部，人参皂苷Rg3 处理Hippo 通路激活成分MST1/2 和LATS1/2 的表达增加，由此可见人参皂苷Rg3 可能通过Hippo 通路抑制非小细胞肺癌细胞的干性而逆转对奥希替尼的耐药。Hu 等［48］发现金丝桃苷抑制了T790M 阳性NSCLC 细胞增殖，诱导细胞凋亡，上调了FoxO1 的表达，下调lncRNA 结肠癌相关转录本1（CCAT1）的水平。同时金丝桃苷抑制了T790M 阳性NSCLC 移植瘤的生长。提示金丝桃苷可能是通过CCAT1 上调FoxO1 后在T790M 突变的非小细胞肺癌细胞中显示出抗癌活性。Cao 等［49］发现蟾蜍灵联合奥希替尼有效地恢复了奥希替尼耐药肺腺癌细胞株PC9/OR 和HCC827/OR 的药物敏感性，将PC9/OR 细胞过表达MCL-1 后消除了蟾毒灵诱导的细胞凋亡，Ku70 过表达后显著抑制蟾毒灵诱导的细胞凋亡和MCL-1 表达，表明奥希替尼和蟾蜍灵联合可能是通过抑制Ku70 介导的MCL-1 过表达消除对奥希替尼的耐药性。

近年来，中医药复方联合奥希替尼治疗NSCLC获得性耐药的研究较为少见，但是中药复方多靶点﹑多层次的药效特点仍具有极大的治疗潜力，值得进一步研究。

5 小结

肺癌仍是全球癌症死亡的主要原因，EGFRTKIs 的引入显著改善了EGFR 突变的晚期NSCLC患者的预后。EGFR-TKIs 获得性耐药难以避免且其机制复杂，目前治疗EGFR-TKIs 获得性耐药的方法不多。中药具有多途径﹑多层次﹑多靶点﹑不易耐药等特点，能调控多个下游通路达到抗肿瘤的目的。此外，中药在改善EGFR-TKIs 的不良反应，延缓甚至逆转EGFR-TKIs 耐药方面具有独特作用。虽然目前较多临床研究证实中药协同EGFRTKIs 抗NSCLC 耐药有显著作用，但仍缺乏临床前瞻性﹑多中心﹑大样本的统计数据，说服力尚不充足。中药抗NSCLC 的耐药机制主要集中在临床验证及药效学研究阶段，不少研究探索了其作用机制及通路，但逆转和延缓耐药机制大多为下游靶点的激活，机制比较单一化，缺乏权威性的论证。笔者认为中医药在抗肿瘤耐药领域具有巨大潜力，深入探索中医药治疗NSCLC 耐药的辨证论治体系和机制，以及临床的安全和有效性非常重要。