免疫胶体金法与间接免疫荧光法检测对下呼吸道感染患儿肺炎支原体感染的诊断价值分析

曲奎尧，张珊，谢春艳，董彦茂，张传仓

肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是儿童呼吸道感染的重要病原体之一。MP 感染常见于学龄前期及学龄期儿童，近年来婴幼儿感染亦有不少报道［1-2］。MP 感染的临床表现不典型，缺少特异性，仅依据临床表现难与其他病原体引起的呼吸道感染相鉴别。加之自2000 年以来研究表明大环内酯类耐药MP 的证据越来越多［3］，因此，快速有效的实验室诊断尤为重要。本研究回顾性分析在海军第九七一医院儿科住院当天利用免疫胶体金法（immune colloidal gold technique，GICT）与住院次日利用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）同时行MP-IgM 抗体检测的下呼吸道感染患儿的临床资料，评价2 种检测方法对MP 感染的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019 年1-12 月在海军第九七一医院住院的985 例下呼吸道感染患儿的临床资料。985 例患儿中，男515 例，女470 例，男∶女=1.1∶1，年龄1 个月～14 岁；其中支气管肺炎390 例，普通肺炎572 例，大叶性肺炎23 例。选取入院当天在医院门诊利用GICT 并在入院次日利用IFA 行MP-IgM 检测且发病病程均≥4 d 的134 例患儿的临床资料。其中支气管肺炎25 例，普通肺炎100 例，大叶性肺炎9 例。根据患儿年龄将其分为＜3 岁组、3～6 岁组、＞6 岁组。根据患儿发病病程将其分为4～7 d 组和＞7 d 组。

1.2 方法

1.2.1 GICT 采用北京贝尔生物工程有限公司生产的MP-IgM 检测试剂盒进行检测。取入院当天门诊下呼吸道感染患儿末梢血20 μl 进行检测。严格按照说明书进行操作，15～20 min 判断结果。对照线和检测线均出现为阳性；只显示对照线为阴性；对照线不显示及超过20 min 判断结果无效。

1.2.2 IFA 采用西班牙Vircell 公司生产的9 项呼吸道感染病原体IgM 抗体检测试剂盒。入院次日清晨患儿空腹抽取静脉血3 ml 进行检测，检测方法及质控要求严格按说明书进行。用免疫荧光显微镜观察结果，以效价＞1∶16 为阳性。

1.3 临床MP 感染诊断

根据患儿临床症状（以咳嗽和/或发热为最主要症状）、体征（肺部体征轻与发热、剧咳不一致）、影像学检查（X 线改变明显而肺部体征轻）及大环内酯类抗生素治疗有效等临床特点，由2 名具有主治医师以上职称的儿科医生共同得出临床MP 感染的诊断结论。临床符合率即诊断试验结果与受试者实际情况相符合的概率=［（阳性符合例数+阴性符合例数）/总例数］×100%。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计软件进行分析。计数资料以百分比（%）表示，配对资料的差异性采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

134 例下呼吸道感染患儿中，男63 例，女71 例，年龄6 个月～11 岁，男∶女=0.88∶1。年龄＜3 岁组33 例，3～6 岁组63 例，＞6 岁组38 例。入院前病程4～7 d 组76 例，＞7 d 组58 例。134 例下呼吸道感染患儿中符合临床MP 感染诊断107 例。

2.2 2 种方法MP 检测阳性率比较

134 例下呼吸道感染患儿中，GICT 的MP 检测阳性例数为62 例（46.3%），IFA 为99 例（73.9%），2 种方法MP 检测阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 免疫胶体金法与间接免疫荧光法检测134 例下呼吸道感染患儿MP 结果比较［例（%）］

2.3 2 种方法检测不同年龄组、不同病程组MP 阳性率比较

GICT 和IFA 在年龄＜3 岁组、3～6 岁组、＞6 岁组MP 检测阳性率比较差异无统计学意义（χ2=5.983，P=0.050；χ2=0.403，P=0.818）。见表2。而在4～7 d 组和＞7 d 组的不同病程组中，GICT 对MP检测阳性率分别为34.2%、58.6%，差异有统计学意义（χ2=7.927，P=0.005）；IFA 对MP 感染检测阳性率分别为65.8%、84.5%，差异有统计学意义（χ2=5.957，P=0.015）。见表3。

表2 免疫胶体金法与间接免疫荧光法检测不同年龄组患儿MP 感染阳性率比较［例（%）］

表3 免疫胶体金法与间接免疫荧光法检测对不同病程组患儿检测MP 感染阳性率比较［例（%）］

2.4 2 种方法检测MP 感染临床符合率比较

利用GICT 检出MP 感染阳性例数62 例，阴性例数72 例，其中阳性诊断符合的54 例，阴性诊断符合的19 例，共73 例符合临床诊断，符合率为54.5%；IFA 检出MP 感染阳性例数99 例，其中阳性诊断符合的90 例，阴性诊断符合的18 例，共108 例符合临床诊断，符合率为80.6%；2 种方法临床符合率比较差异有统计学意义（χ2=21.927，P＜0.01）。见表4。同时，在不同病程组之间对MP 感染临床符合率比较分析，4～7 d 组76 例，2 种检测方法对MP 感染检出均阳性17 例，其中符合临床MP 感染15 例，不符合2 例，阳性符合率88.2%；2 种检测方法对MP 感染检出均阴性15 例，其中临床阳性诊断7 例，符合临床阴性诊断8 例，阴性符合率为53.3%。＞7 d 组58 例，2 种检测方法均阳性30 例，均符合临床支原体感染阳性诊断，阳性符合率100%；2 种检测方法均阴性5 例，4 例符合临床支原体阴性诊断，阴性符合率为80.0%。见表5。

表4 免疫胶体金法与间接免疫荧光法检测MP 感染临床符合率比较（例）

表5 免疫胶体金法与间接免疫荧光法检测均阳性、均阴性在不同病程组间对MP 感染临床诊断情况比较（例）

3 讨论

MP 属柔膜体纲，支原体属，是一类无细胞壁、呈多形性、能够自我复制、不依靠活体细胞而生存的最小微生物［4］。由于缺乏细胞壁，因此对作用于细胞壁的抗菌药物具有耐药性［3］。MP 呼吸道感染的致病机制主要通过粘附及细胞毒效应对呼吸道上皮直接损伤和免疫机制引起呼吸道及肺外损伤［5-6］。MP 是儿童呼吸道感染的重要病原体，经飞沫和直接接触传播，潜伏期l～3 周，潜伏期内至症状缓解数周均有传染性。MP 呼吸道感染临床表现呈多样性，可以从无症状到鼻咽炎、鼻窦炎、中耳炎、咽扁桃体炎、气管支气管炎和肺炎等［7］。MP 肺炎发生率约是普通肺炎的20 倍，而10%～40% 的MP 呼吸道感染会发展成肺炎［7-8］。目前MP 是我国社区获得性肺炎的主要病原体，约占小儿肺炎的10%～20%。MP 肺炎主要临床表现为发热和咳嗽，发热程度不一，可表现为高热、中等度热或低热，甚至无热。咳嗽主要为刺激性干咳，个别患儿会出现类百日咳样咳嗽。MP 肺炎可导致肺外并发症，几乎可以累及全身各个系统，如皮肤黏膜系统、神经系统、心血管系统、消化系统、血液系统、泌尿系统等，发生率约25.0%。目前大环内酯类抗生素仍为儿童MP 感染的首先用药，但自2001 年日本学者首次发现大环内酯类抗生素耐药的MP（macrolide-resistant MP，MRMP）报道后［9］，中国、欧洲及美国相继分离出MRMP 菌株。由于大环内酯类抗生素在儿童中的单一、过度及不规范用药，目前世界各国MRMP 急剧增加，尤其在东亚国家耐药率更高［10］。日本有研究显示2015 年MP 的耐药率为43.6%［11］。2008-2012 年连续5 年监测北京MP 的耐药率分别为68.9%、90.0%、98.4%、95.4%、97.0%［12］。鉴于上述特点，急需研究能够及时准确地判断MP 感染的实验室诊断方法。儿童MP 感染的实验室诊断方法包括MP 病原体培养、MP 核酸检测、MP 抗原直接检测、MP 血清抗体检测。其中，MP 培养阳性是判断MP 感染的“金标准”，但由于对培养环境要求苛刻且培养周期长，对临床早期诊断意义不大。MP核酸检测包括DNA 和RNA 检测，具有灵敏度高、检测速度较快的特点，但特异性相对不足，不能区分其是由机体自身携带还是现行感染，且对标本保存及采集人员标准要求较高［13-14］。MP 抗原直接检测特异性较高，但灵敏度低。由于MP 感染患者的咽拭子病原体含量一般为1×105～1×106CFU/L，而该方法最小检测含量一般为1×106CFU/L，故易引起假阴性［15］。MP 血清抗体检测由于方法简单，临床应用较广，常用方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、颗粒凝集法（PA）、GICT、化学发光法（CLIA）、IFA。MP 感染机体后，体内可产生特异性的IgM 抗体，IgM 抗体一般在感染后4～5 d 出现，3～4 周后达高峰，持续1～3 个月甚至半年以上，可作为近期感染的诊断指标［7,16］。GICT 检测简便，可用末梢全血，所需血量少，出具结果迅速，适合门诊或急诊患儿疑似MP 感染的快速筛查［7］。IFA 需静脉血，出具结果相对较慢，该方法多应用于住院儿童。在临床诊治过程中发现，住院儿童中2 种方法检测结果既存在一致性又有差异，为了探讨2 种方法的临床，本研究回顾性分析2019 年在海军第九七一医院住院的下呼吸道感染患儿的临床资料。鉴于MP 产生抗体的时间，本研究在筛选病例时剔除了发病病程＜4 d 的病例。在符合条件的134 例下呼吸道感染患儿中，2 种检测方法均阳性47 例，均阴性20 例。其中GICT 检出MP 感染阳性例数62 例，检测阳性率为46.3%，73 例符合临床诊断，符合率54.5%；IFA 检出MP 感染阳性例数99 例，检测阳性率为73.9%，108 例符合临床诊断，符合率80.6%；经统计分析2 种方法对MP 检测阳性率及临床符合率均差异有统计学意义。虽然2 种方法在不同年龄组对MP 检测阳性率差异无统计学意义，但2 种检测方法均随着患儿年龄段的增加而检出阳性率升高，尤其在＞6 岁组检出阳性率最高，这与临床中MP 感染主要发生在学龄期儿童一致。通过在不同病程组比较分析发现，2 种方法均在病程4～7 d 的患儿MP 感染检测阳性率较低，2 种检测方法均阳性与MP 临床诊断阳性符合率为88.2%，但阴性符合率仅为53.3%；而在病程超过7 d 的患儿MP 感染检出率更高，且2 种检测方法均阳性与临床MP 感染判断完全符合，阳性符合率100%，同时阴性符合率为80.0%。因此，对病程超过7 d 的患儿，2 种检测方法联合使用可为临床判断提供重要决策，而对病程4～7 d 的患儿仅单独采用血清特异性IgM 抗体方法判断有无MP 感染仍需谨慎，需要结合临床综合判断或联合其他实验室检测方法。鉴于国内MP检测的试剂盒厂家众多，每种方法的敏感性和特异性不同，中华医学会儿科分会临床检验学组建议有条件的实验室至少开展2 种以上的检测方法来相互弥补之不足［13］。李少丽等［17］认为，临床上不能通过单份血清抗体检测阳性来确诊MP 感染，建议采用血清法和PCR 联合检测。另外，本研究中对于GICT 检测阳性率低的结果考虑存在以下原因：不同公司生产的试剂盒的质量会对结果造成一定影响；该研究中运用GITC 采血的时间相对IFA 要提前约1 d，抗体产生的量相对少。

本研究发现，虽然在不同年龄段2 种方法对MP 检测阳性率无差异，但在小年龄组，2 种方法的检测阳性率均最低，考虑原因是由于小年龄组免疫功能不完善，机体产生抗体能力较弱。根据上述特点，2019 年中华医学会儿科分会临床检验学组专家共识提出，根据患者现在和既往的症状、门诊和住院、筛查和确诊等不同的感染情况选择不同的检测方法，为临床MP 感染的诊断提供合理、经济、高效的参考建议。此外，中国儿童MP 感染实验室诊断规范和临床实践专家共识（2019 年）提出可根据患儿年龄、免疫功能状态、病程及就诊医院等级对MP感染提出分层推荐的实验室诊断方法。

本研究发现，IFA 较GICT 对MP 感染的检测阳性率及临床符合率均更高，且二者之间差异有统计学意义。2 种方法在不同年龄组对MP 感染检测阳性率无差异，但随着患儿年龄增加，阳性率均升高。在不同病程组2 种方法对MP 检测阳性率均差异有统计学意义，且对发病病程超过7 d 的患儿检测阳性率更高，二者联合检测均阳性与临床MP 感染阳性判断完全符合。对于病程4～7 d 的患儿仍需结合临床或联合其他实验室诊断方法进行判断。