金黄色葡萄球菌SPA分型及毒力基因检测

孟祥兆，于洪远，孟淑萍

1.北京航天总医院检验科，北京 100076；2.北京海淀医院儿科，北京 100080

在临床分离到的致病性革兰阳性球菌中最常见的一种就是金黄色葡萄球菌（SA），可引起多种严重的临床感染，如血流感染引起败血症、皮肤软组织感染引起疖、呼吸系统感染引起肺炎等。金葡菌引起感染性疾病的主要原因是能分泌多种外毒素，主要包括：肠毒素（SEs）、杀白细胞毒素（PVL）、中毒休克综合征毒素-1 （TSST-1）、表皮剥脱性毒素（ETs）等，可导致患者产生化脓性感染、食物中毒等临床症状，严重的可以引起中毒性休克综合征等致死性疾病［1］。目前，临床针对葡萄球菌蛋白A（SPA）基因的多态性进行测序，进而对葡萄球菌进行SPA基因分型分析，以获得其流行病学信息。在控制由SA 感染引起的短期爆发流行或医院内传播时，可以提供基础理论依据，为控制SA 的感染与传播提供有力支持［2］。本研究使用PCR扩增及测序等分子生物学方法对该研究时间段内从北京航天总医院临床分离到的SA 菌株进行流行病学信息调查，旨在获取本院SA 的优势流行菌株的分子生物学信息和毒力基因携带情况，进而为控制SA 的感染和传播提供基础理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年10 月—2019 年3 月北京航天总医院检验科微生物室分离得到的临床来源非重复金黄色葡萄球菌50株，其中来源于痰液35株、血液6株、脓液3株。其他来源6株（包括尿液、胸水、腹水等）。所有菌株均-80 ℃留存待用。

1.2 仪器与试剂

VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析仪（法国梅里埃公司）；96 孔PCR 仪（上海宏石公司）；TOCAN凝胶成像系统（上海天呈公司）；细菌基因组DNA提取试剂盒（A1120，普洛麦格（北京）生物技术有限公司）；PCR 纯化回收试剂盒（DP214，北京天根生物技术有限公司）；PCR 扩增上下游引物以及PCR 酶和预混液（赛默飞公司）。

1.3 方法

1.3.1 复活已经收集到的50 株实验菌株 使用梅里埃VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行菌株鉴定及药敏试验。

1.3.2 金黄色葡萄球菌DNA 提取 提取所有复活的SA 实验菌株的DNA，均使用普洛麦格细菌基因组DNA 提取试剂盒（A1120），操作过程均按照试剂盒说明书进行。得到的DNA作为PCR扩增的模板。

1.3.3 mecA 基因、PVL 基因以及毒素基因的检测 经过前期实验验证后本研究使用扩增程序检测mecA 基因和PVL 基因，其中mecA 基因扩增引物序列为mecA-F：5-AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3，mecA-R ：5-AGT TCTGCAGTACCGGATTTGC-3，PVL 基因扩增引物序列为PVl-F:5-ATCATTAGGTAAA ATGTCTGGACATGATCCA-3;PVl-R:5-GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC-3。另检测了SEA、SEB、SEC、ETA、TST 及sasX 共6 种毒素基因，检测方法及扩增引物序列均参照文献［3］。获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统观察到出现目的条带的为相应基因阳性，无目的条带的为相应基因阴性。经过药敏鉴定头孢西丁耐药或PCR 扩增mecA 基因阳性的SA定义为MRSA。

1.3.4 SPA 分型 根据序列及实验要求设计SPA 分型PCR扩增引物和反应体系及扩增程序。对扩增所得到的阳性产物进行纯化和回收后，送生工生物有限公司进行测序。使用Bionumerics 6.6 软件对测序数据进行分析，根据串联重复序列的排列方式确定菌株的SPA型别。

2 结果

2.1 MRSA检测

根据苯唑西林药敏结果发现，50 株SA 中包括28 株MRSA（56%）和22株MSSA（44%）。28株MRSA中mecA基因均为阳性，22株MSSA中mecA基因均为阴性。

2.2 毒力基因检测结果

50 株菌中，携带率最高的毒素基因是SEA 为84.0%，而TST、sasX 均未检测到阳性菌株，在两株MSSA 中检测到ETA阳性，4株MSSA中检测到SEB阳性，1株MSSA中检测到SEC 阳性，并且在MRSA 和MSSA 中差异无统计学意义。PVL基因阳性的有2株（4.0%），两例菌株均来源于穿刺液标本，SPA 分型为MSSA-t701 和MSSA-t037，通过药敏实验发现该两例菌株仅对青霉素耐药。毒素基因阳性的菌株，有12株可同时携带两种毒素基因，共组成4种毒素基因型，包括：SEA+ETA 2 株，SEA+SEB 4 株，SEA+PVL 1株，SEA+ SEC 1株。具体结果见表1、表2。

表1 实验菌株基因筛查结果 例（%）

表2 SPA分型和毒素基因筛查结果

2.3 SPA分型结果

28株MRSA中，23株为t030（82.1%），主要来源是痰液（20株），2株为t019（7.1%），2株为t1081（7.1%），1株为t748（3.5%）。从22 株MSSA 中，共检测到12 种SPA型别，以t1451、t091、t078 位列前3 位，分别占22.7%、18.2%、13.6%，除1 株MSSA 为t030 外，未发现其他与MRSA 具有相同SPA 分型的MSSA 菌株，另有1 株无法分型，见表3。

表3 实验菌株SPA型别重复序列

3 讨论

临床分离到的SA 尤其是MRSA 具有多部位感染和多药耐药的特性，使其成为最重要的院内感染病原菌之一。因此，MRSA 与HBV 及AIDS 并列为世界三大难解决的感染性疾病。多项研究表明携带mecA 基因是MRSA 耐β-内酰胺类抗菌药物的主要原因之一，因此众多研究将mecA基因的存在作为研究MRSA的重要分子标记。临床上分离到的金黄色葡萄球菌株在分子生物学特征上具有多态性，目前常用的区分其基因多态性的方法主要有多位点序列分析、SPA、基因分型以及葡萄球菌盒式染色体分型等。根据不同的分型方法可以将临床分离到的菌株区分为不同的克隆株，有些克隆株为优势流行克隆，有些为偶发株，不同克隆株对抗菌药物表现出不同的耐药性，携带的毒力基因也不同［4］。因此明确特定区域特定疾病的SA 的克隆分型及其分子特征对控制及治疗SA感染有重要意义。

SPA是SA细胞壁的重要组成成分之一，该蛋白由一段分子长度约为2 150 bp的基因序列进行编码产生，该段序列主要由Fc结合区、X区和C末端组成。其中X区含有2～15个数量不等，长约21～27 bp的重复序列，由于重复序列数目、特征和排列顺序不同导致X 区具有高度的多态性，针对这段基因的多态性所建立的分型方法为SPA分型，该方法具有快速、易操作、重复性好的特点，并且操作成本较为低廉，适用于SA 感染的分子流行病学调查。本研究选择使用该分型方法作为区分菌株多态性的手段。MRSA的SPA流行型别在我国有很大的地域分布差异，本研究发现，医院该阶段临床分离到的MRSA 的主要型别是t030，与文献报道的t030 为我国主要的流行克隆型之一结果一致，t030 不仅在我国广泛分布，也是挪威、德国、荷兰、瑞士、瑞典等国家的主要流行克隆型［5］。与MRSA呈现高度的克隆一致性不同，MSSA的分型较为分散，共检出12个克隆型，并没有优势克隆型的出现，除1 株MSSA 为t030 外，未发现其他与MRSA 具有相同SPA 分型的MSSA菌株。SA致病性强，能够引起患者多种临床症状与SA能够产生多种外毒素有密切关系。SA 是否携带毒素基因，与感染后引起的临床症状的严重程度成正相关。因此，在对SA 进行研究时有必要对金葡菌携带的毒素基因进行筛查。目前主要筛查的是SA 是否能产生肠毒素、杀白细胞毒素、中毒休克综合征毒素-1、表皮剥脱性毒素。本研究选择筛查了3种金葡菌肠毒素基因：SEA、SEB、SEC，剥脱毒素基因ETA，中毒休克综合征毒素基因tst-1，以及sasX毒素基因和PVL毒素基因。本研究检测的3种肠毒素基因，SEa携带率最高为84.0%，且在MRSA和MSSA中无明显区别。携带SEB 基因的有四株，均为MSSA，均仅对红霉素E、克林霉素CL、庆大霉素CN、青霉素P耐药。这说明本院流行的SA 以携带的肠毒素基因以SEA 为主。sasX 基因可以编码一种新的细胞壁锚定蛋白，从而增加SA的粘附和聚集能力，使得SA更易引起感染症状［6］。本研究未检出医院分离到的SA 携带sasX 基因，可能与本地区流行的菌株携带该毒素基因较少有关。

PVL 属于膜穿孔毒素，可以增强SA 对宿主的抵抗力，与医院获得性SA相比，社区获得性SA具有相对较高的PVL毒素基因携带率。本研究只筛查到两株PVL阳性的MSSA，其中一菌株同时还携带有毒素基因SEA，且只对青霉素耐药。检出率远低于文献报道的30%［7］，分析原因可能是和本实验收集到的菌株多为医院获得性SA，并且PVL 毒素基因目前在本地区的SA 中携带较少。明确流行环节、切断传播途径、终止耐药菌株在医院和社区中的传播是感染控制的重要策略之一，而掌握SA 的分子特征对于有效控制感染和鉴别菌株之间是否存在相关性至关重要。本研究虽然仅部分代表了医院该阶段内SA 的分子流行病学情况，但是为SA 的临床治疗、感染控制和爆发流行监测提供了有力依据。