杜仲叶乙醇提取物抑菌试验

郭 菡,徐溶蔓,原 梦,杨月琴,朱文学

(1.河南科技大学 农学院,河南 洛阳 471023;2.河南工业大学 粮油食品学院,河南 郑州 450001)

0 引言

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)为杜仲科杜仲属落叶乔木,栽培历史悠久[1],是中国特有的名贵药材和木本油料树种[2]。杜仲干燥树皮入药,用于肝肾不足、腰膝酸痛和筋骨无力等症[3]。现代研究表明,杜仲还有降血糖、降血脂、抗氧化等多种药理作用[4],也是常用的食品添加剂[5-6]。

目前,主要围绕育种、药材栽培与种植、化学成分分析、资源调查、药理及保健功能开发等方面对杜仲进行研究[7-8],已先后从杜仲中分离得到木脂素类[9-13]、环烯醚萜类[14-16]、苯丙素类[17-20]、黄酮[21]、多糖[22]、氨基酸[23-25]及杜仲胶[26-27]等70余种化合物以及钙、铁等15余种矿物质元素[28]。研究表明,杜仲叶和杜仲皮中所含活性成分大体一致,药理作用也相似[29],具有较好的抗氧化活性和抑菌活性,在减抗替抗的纯天然饲料添加剂开发、畜牧业养殖等方面应用前景广阔,成为研究的热点[30-34],但对于其抑菌活性的机理研究未见报道。

本研究利用乙醇提取杜仲叶中的活性成分,再经由系统溶剂提取法萃取、分离(溶剂使用顺序为石油醚—乙酸乙酯—正丁醇)得到3个极性部分,最后通过硅胶柱层析配合梯度洗脱法(氯仿/甲醇洗脱液)进一步分离纯化,经过薄层层析试验合并类似洗脱组分后,从其中2个极性部分(乙酸乙酯、正丁醇)各得到5个洗脱组分,作为抑菌活性分析的材料。

1 材料与方法

1.1 材料

细菌菌株：大肠杆菌 (Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),依次标记为受试菌1、2、3、4;真菌菌株：根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger) 、青霉(Penicilliumsp.),依次标记为受试菌5、6、7。

杜仲叶采摘于洛阳市汝阳县王坪乡杜仲种植基地。采取加热回流提取法制得杜仲叶乙醇提取物,经由系统溶剂法萃取分离和硅胶柱层析法进一步纯化,得到抑菌活性分析的材料。

乙酸乙酯极性组分质量浓度为0.14 g/mL;正丁醇极性质量浓度为0.13 g/mL。

1.2 试剂

牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 15 g/L、琼脂20 g/L);马铃薯培养基(马铃薯200 g/L、蔗糖20 g/L、琼脂20 g/L)。

1.3 仪器

本试验所用主要仪器为超净工作台、恒温培养箱、旋转蒸发器等。

1.4 抑菌活性试验

1.4.1 试验方法

杜仲叶活性提取物抑菌试验。采用改良的打孔法：在超净工作台内,用移液枪吸取150 μL已稀释好的菌液,均匀涂布在平板上,利用灭菌后的玻璃管在平板上打孔,挑出孔中培养基后用火焰封底(打孔管两端光滑,外径约4 mm,孔径和孔距约3 mm);将不同稀释倍数的样品注入孔中(加满但不外溢),37 ℃培养箱中培养。

最小抑菌浓度试验。采用改良的二倍稀释法：在超净工作台中,每个试管均吸取2 mL液体培养基放入已灭菌的试管中,在第1支试管中加入2 mL已配制的一定稀释倍数的样品溶液,混匀后吸取2 mL放进第2支试管,以此类推,逐个试管进行稀释至第5支试管,第6支为阳性对照。之后,在各试管内加入0.1 mL相应的稀释至适当浓度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌悬菌液,置于恒温培养箱37 ℃培养24 h,肉眼观察,试管中液体培养基如果澄清并且摇匀后仍澄清,则判断无菌生长,且试管中的样品浓度是最小抑菌浓度。

1.4.2 结果观察

抑菌试验中,注入打孔琼脂平板中的样品向周围扩散,并且浓度呈梯度递减,经过若干小时培养后会出现抑菌圈,其大小和样品的抑菌效果强弱正相关,同时受样品稀释倍数及接种菌液稀释倍数的影响。

1.4.3 判定标准

以平板中抑菌圈直径大小作为判断药敏试验中敏感度高低的标准。

2 试验结果与分析

2.1 最适稀释倍数菌液筛选

本试验通过比较不同细菌和真菌稀释前后吸光度值的变化,筛选最适涂布的菌液稀释倍数,以达到更好观察提取物抑菌效果目的。图1为最适涂布菌液筛选结果。图1中：受试菌1稀释前、稀释2 000倍分别表示为a、b;受试菌2稀释前、稀释100倍分别表示为c、d;受试菌3稀释前、稀释100倍分别表示为e、f;受试菌4稀释前、稀释100倍分别表示为g、h;受试菌5稀释前、稀释200倍分别表示为j、k;受试菌6稀释前、稀释100倍分别表示为m、n;受试菌7稀释前、稀释200倍分别表示为p、q。图1表明：菌悬液吸光光度值为0.006 A左右时,涂布后菌落致密程度均匀,适合抑菌试验。

图1 最适涂布菌液筛选结果

2.2 杜仲叶乙醇提取物乙酸乙酯部分各洗脱组分抑菌效果

2.2.1 洗脱组分Ⅰ、Ⅲ抑菌效果分析

洗脱组分Ⅰ(V(氯仿)∶V(甲醇)=90∶10)、Ⅲ(V(氯仿)∶V(甲醇)=70∶30)抑菌情况见图2。图2a显示洗脱组分Ⅰ处理下,杜仲叶乙醇提取物乙酸乙酯部分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、枯草芽孢杆菌和根霉都有不同程度的抑菌效果,其中对炭疽杆菌的抑制效果最好,但随着稀释倍数的增大,抑菌效果逐渐减弱,而对根霉在稀释2倍时有抑菌活性。图2b表明洗脱组分Ⅲ处理下,杜仲叶乙醇提取物乙酸乙酯部分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和青霉有不同程度的抑菌活性,整体表现为随着稀释倍数增大,抑菌活性逐渐减弱。也是对炭疽杆菌的抑菌效果最好,仅在稀释2倍时对黑曲霉和青霉有微弱的抑菌效果,但对根霉没有抑菌活性。

(a) 洗脱组分Ⅰ抑菌效果

2.2.2 洗脱组分Ⅱ抑菌效果分析

表1为乙酸乙酯部分洗脱组分Ⅱ抑菌效果。由表1可知：洗脱组分Ⅱ(V(氯仿)∶V(甲醇)=80∶20)处理下,乙酸乙酯部分对炭疽杆菌的抑制作用最显著。当稀释倍数增加时,对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌抑制作用减弱较显著。

表1 乙酸乙酯部分洗脱组分Ⅱ抑菌效果 mm

2.2.3 洗脱组分Ⅳ、V抑菌效果分析

表2为乙酸乙酯部分洗脱组分Ⅳ、Ⅴ抑菌作用结果。从表2可以看出：洗脱组分Ⅳ(V(氯仿)∶V(甲醇)=60∶40)、洗脱组分Ⅴ(纯甲醇)处理下,获得的杜仲叶乙醇提取物乙酸乙酯成分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌均有抑制作用。其中,对炭疽杆菌的抑制作用最好,最大抑菌圈直径可达22.0 mm。洗脱组分Ⅳ在稀释倍数增加后抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的能力明显减弱,而洗脱组分Ⅴ的抑菌活性受稀释倍数影响较小。

表2 乙酸乙酯部分洗脱组分Ⅳ、Ⅴ抑菌作用结果 mm

上述抑菌试验结果表明,基于杜仲叶乙醇提取物乙酸乙酯部分设置的5个极性洗脱组分对4种细菌均有一定抑制作用,对炭疽杆菌的抑制作用最强,对枯草芽孢杆菌的抑制作用最弱。低极性洗脱组分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的抑制作用随着稀释倍数增加下降较明显,而高极性洗脱组分(Ⅳ、Ⅴ)的抑制作用受稀释倍数影响较小,5个洗脱组分对真菌的基本没有抑制作用。

2.3 乙酸乙酯部分各极性洗脱组分最大有效稀释倍数

杜仲叶乙醇提取物乙酸乙酯部分5个极性洗脱组分最大有效稀释倍数试验采用二倍稀释法,即将5个极性洗脱组分分别按照4倍、8倍、16倍、32倍、64倍,5个稀释倍数进行稀释,各取100 μL置于装有菌液悬液和培养基混合液的试管中,于37 ℃培养24 h,观察。如果试管内的液体清澈,则说明该稀释倍数下对受试菌有抑制作用,如果液体浑浊,则说明无抑制作用。乙酸乙酯部分不同洗脱组分的最大有效稀释倍数见表3。

表3 乙酸乙酯部分不同洗脱组分的最大有效稀释倍数

从表3可以看出：洗脱组分Ⅱ对炭疽杆菌和金黄色葡萄球菌最大有效稀释倍数高于大肠杆菌,和抑菌试验结果一致。洗脱组分Ⅰ在4倍稀释后对3种细菌均有抑制作用,较洗脱组分1略弱。洗脱组分Ⅲ在16倍稀释后对炭疽杆菌仍有抑制作用,和洗脱组分Ⅰ、Ⅱ相比,对3种细菌的抑制作用均有所增强。洗脱组分Ⅳ则在32倍稀释后仍对炭疽杆菌有抑制作用,同时能够较强抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。洗脱组分V在较高稀释倍数下对3种细菌均有抑制作用。

2.4 杜仲叶乙醇提取物正丁醇部分各极性洗脱组分抑菌效果

2.4.1 洗脱组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的抑菌效果分析

在洗脱组分Ⅰ(V(氯仿)∶V(甲醇)=90∶10)、Ⅱ(V(氯仿)∶V(甲醇)=80∶20)、Ⅲ(V(氯仿)∶V(甲醇)=70∶30)处理下,杜仲叶乙醇提取物正丁醇部分抑菌作用见表4。表4显示：洗脱组分Ⅰ能够较强抑制炭疽杆菌,对金黄色葡萄球菌抑制作用则稍弱;洗脱组分Ⅱ的抑菌作用受稀释倍数影响较大,当稀释倍数较低时,才具有明显的抑菌作用;洗脱组分Ⅲ能够较强抑制炭疽杆菌,对金黄色葡萄球菌抑制作用则稍弱,稀释倍数增加抑制作用均有下降,但对炭疽杆菌抑制作用受稀释倍数影响相对较小。

表4 正丁醇部分洗脱组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ抑菌作用 mm

2.4.2 洗脱组分Ⅳ、Ⅴ抑菌效果分析

洗脱组分Ⅳ(V(氯仿)∶V(甲醇)=60∶40)、Ⅴ(纯甲醇)处理下,杜仲叶乙醇提取物正丁醇部分抑菌效果如图3所示。图3a显示洗脱组分Ⅳ处理下,杜仲叶乙醇提取物正丁醇部分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、枯草芽孢杆菌和根霉都表现为一定的抑菌活性,也是随着稀释倍数增大,抑菌活性减弱,其中对炭疽杆菌的抑菌效果最好,而对枯草芽孢杆菌和根霉仅在稀释2倍时表现出抑菌活性。图3b显示：在洗脱组分Ⅴ处理下,杜仲叶乙醇提取物正丁醇部分仅对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌具有抑制作用,对另外4种受试菌都没有抑菌作用,和洗脱组分Ⅳ处理一样,稀释8倍时对大肠杆菌均没有抑制作用。

(a) 洗脱组分Ⅳ抑菌效果

2.5 正丁醇部分各极性洗脱组分最大有效稀释倍数

正丁醇部分各极性洗脱组分均能在一定程度上抑制4种细菌生长,通过与乙酸乙酯部分相同的方法测定5种洗脱组分处理下,正丁醇部分对受试细菌和真菌的最大有效稀释倍数。表5为正丁醇部分不同洗脱组分的最大有效稀释倍数。

表5 正丁醇部分不同洗脱组分的最大有效稀释倍数

表5表明：洗脱组分Ⅰ对3种细菌的最大有效稀释倍数有明显差别,对炭疽杆菌的最大有效稀释倍数为16倍。洗脱组分Ⅱ在16倍稀释后仍能抑制炭疽杆菌。洗脱组分Ⅲ对炭疽杆菌抑制效果与洗脱组分Ⅱ类似。洗脱组分Ⅳ在32倍稀释后仍对炭疽杆菌有抑制作用,在正丁醇5个洗脱组分中,抑菌效果比较好。洗脱组分Ⅴ对炭疽杆菌最大有效稀释倍数为32倍。

3 结论

(1)杜仲叶乙醇提取物乙酸乙酯部分、正丁醇部分各极性洗脱组分对除枯草芽孢杆菌之外的另外3种细菌均有不同程度的抑制作用。其中,对炭疽杆菌的抑制作用最强,最大抑菌圈直径可达到22.0 mm;对金黄色葡萄球菌的抑制作用次之,对大肠杆菌的抑制作用则较弱,而对黑曲霉、青霉和根霉3种真菌没有抑制作用。

(2)正丁醇部分和乙酸乙酯部分各极性洗脱成分的抑菌作用差别不大,极性较大的洗脱组分对细菌的抑制作用较极性较小的洗脱组分强,且受稀释倍数影响较小,即随着稀释倍数增加,抑菌作用减小的程度比较小。

(3)乙酸乙酯部分和正丁醇部分各极性洗脱组分没有太大差别,其中对炭疽杆菌的最大有效稀释倍数可以达到32倍。

(4)本研究初步分离了杜仲不同极性、不同类型的化合物,为后续杜仲活性成分的筛选和天然产物的开发奠定了坚实的基础。