hnRNPU 过表达抑制PIM1 诱导的细胞衰老的机制研究

肖雅雯，阳检明

（天津医科大学基础医学院免疫学系，天津 300070）

原癌基因诱导的衰老发生在肿瘤形成的早期，能够限制癌基因突变所导致的细胞增殖，使肿瘤维持在非侵袭性的癌前病变状态，被认为是一种肿瘤抑制机制。原癌基因人前病毒整合位点1（proviral integration site 1，PIM1）最早是作为小鼠白血病病毒的前病毒插入点而被发现的[1]，它能编码一个组成激活型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PIM1 通过磷酸化多种底物起到调节细胞增殖、生存、分化、凋亡和耐药的作用[2-3]。有研究表明，在衰老细胞中，PIM1的表达显著升高，衰老细胞中白细胞介素（IL）-6/信号转导与转录因子3（STAT3）通路能够直接上调PIM1的表达[4]。PIM1 诱导的细胞衰老限制了PIM1 在非肿瘤细胞中的原癌基因特性，但当细胞绕过衰老程序后，PIM1 又呈现出促肿瘤的特性。虽然笔者前期文章发现UHRF1 的下调是PIM1 诱导细胞衰老的一个重要机制，但是过表达UHRF1 并不能完全拯救PIM1 诱导的细胞衰老，表明PIM1 诱导细胞衰老存在其他机制[4-5]。

核异质核糖核蛋白U（heterogeneous nuclear rib onucleoprotein U，hnRNPU）又名脚手架附着因子A，是hnRNPs 蛋白成员之一。hnRNPU 与许多水平的基因调控有关，包括维持核内染色体构象、转录、RNA 剪接和DNA 修复等。hnRNPU 通常在胎儿大脑、成人心脏、肾脏、肝脏、大脑和小脑中表达，主要与活性染色质结合，在有丝分裂中发挥着重要作用。hnRNPU 蛋白能够促进稳健的DNA 复制来确保持续的细胞增殖，hnRNPU 磷酸化和去磷酸化的任何异常都可能导致不正常的有丝分裂从而致病[6-7]。hnRNPs 的家族成员也在RNA 的增强或剪接抑制以及在生理和病理生理条件下维持细胞稳态方面发挥着关键作用[8-9]。最近的多项研究都证实其能够影响肿瘤或神经退行性疾病的发生、发展[10-11]，可能具有成为相关疾病的治疗靶点。有研究证明，hnRNPU 能够与长非编码核糖核酸PANDA 相互作用，在细胞进入和退出衰老过程中起到关键作用[12]。本研究发现hnRNPU 过表达抑制PIM1 诱导的细胞衰老，进一步阐释了PIM1 诱导细胞衰老的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及细胞培养 人胚肺成纤维细胞2BS细胞和人胚肾细胞293T 细胞均购自中国典型培养物保藏中心细胞库。2BS 和293T 细胞复苏后，用含有10%FBS 的DMEM 培养基在37℃恒温，5%CO2培养箱里培养，48 h 传代1 次。

1.1.2 试剂及试剂盒 FBS 胎牛血清和DMEM 培养基购自Gibco 公司；0.25%的胰蛋白酶购自凯基生物公司；Trizol 试剂购自Invitrogen 公司；HiFiScript cDNA Synthesis Kit 和ultraSYBR Mixture 试剂购自北京康为世纪公司；罗氏无EDTA 蛋白酶抑制剂购自瑞士罗氏公司；RIPA 裂解液、RNA 提取试剂盒和衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；转染试剂VigoFect 购自维格拉斯生物技术（北京）公司；银染试剂盒购自Thermo 公司；β-Actin 抗体购自Sigma-Aldrich 公司；p53、p21和p16 抗体购自Santa 公司；hnRNPU 抗体购自Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 质粒构建 构建PIM1 过表达质粒pITAPIM1 和hnNRPU 过表达质粒pITA-hnNRPU，对照质粒为pITA 空载。构建质粒的引物见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.2 细胞转染及病毒稳转2BS细胞 293T 细胞生长密度达40%～60%时，转染前1 h，更换新鲜培养基，取20 μg DNA［（psPAX2：pMD2G：pITA）或者（psPAX2：pMD2G：pITA-PIM1=4∶3∶2）或者（psPAX2：pMD2G：pITA-hnNRPU=4∶3∶2）］加入空白培养基稀释至500 μL，取10 μL VigoFect 加入空白培养基稀释至500 μL，室温放置5 min。将稀释好的DNA 逐滴加入至稀释后的VigoFect，混匀，室温放置15 min，逐滴加入至293T 细胞中培养。转染48 h 和72 h 后，取培养上清感染2BS 细胞，48 h 后用嘌呤霉素筛选。

1.2.3 细胞分组 按上述病毒稳转2BS 细胞后，将细胞分为空载对照组（转入空载对照的2BS 细胞组）、PIM1 组（过表达PIM1 的2BS 细胞组）和PIM1+hn-RNPU 组（同时过表达hnRNPU 和PIM1 的2BS 细胞组）。

1.2.4 Western 印迹检测衰老相关蛋白p53、p21 和p16 以及hnRNPU 表达水平 相应的细胞经预冷的PBS 洗3 遍后，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，将细胞转移至EP 管中，4℃，14 000 r/min，离心20 min 后取10 μL 上清按照BCA 试剂盒说明书进行蛋白定量；剩余的上清加入5×loading buffer，混匀，99℃金属浴，10 min，各组取30 μg 蛋白经10%SDS-PAGE 电泳（压缩胶70 V，分离胶110 V），使目的蛋白充分分离，结束电泳，将其转膜至PVDF 膜上（湿转法，恒压110 V，70 min），用5%BSA 或者脱脂牛奶封闭1 h 后，孵育相应的一抗（稀释比例均为1∶1 000），4℃过夜，用TBST 洗涤3 次，每次15 min，室温孵育相应的二抗（稀释比例均为1∶10 000）1 h，用TBST 洗涤3 次，每次10 min，进行化学发光成像。

1.2.5 衰老相关β-半乳糖苷酶染色实验检测细胞衰老水平 将1×104相应的细胞提前24 h 接种至6孔板中，用PBS 洗涤1 次，加入固定液，室温固定15 min，弃掉固定液后按照试剂盒说明书进行染色，在光学显微镜下拍照，衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性细胞即为衰老细胞，每孔至少拍取5 个随机视野进行统计。

1.2.6 免疫沉淀联合质谱分析实验检测PIM1有效免疫沉淀hnRNPU蛋白 PIM1组和空载Control 组细胞经预冷的PBS 洗3 遍后，每10 cm 细胞培养皿中加入1 mL 含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液，用细胞刮将细胞刮下转移至EP 管中，4℃裂解30 min；4℃，14 000 r/min，离心20 min 后取上清，加入2 μg PIM1 抗体和30 μL G-Sepharose 珠子进行免疫沉淀，4℃孵育过夜；用1 mL 洗涤缓冲液清洗5 次，加入30 μL 5×loading，99℃，金属浴10 min；4℃，500 g 离心5 min 后各组取30 μL 进行10%SDS-PAGE 电泳（压缩胶70 V，分离胶110 V），并按照银染试剂盒说明书进行银染，将差异条带送至公司进行质谱分析。

1.2.7 Real-time PCR 实验检测hnRNPU mRNA 表达水平 提前24 h 将PIM1 组和空载Control 组细胞铺至6 孔板中，待细胞密度生长至80%～90%，加入1 mL Trizol，裂解5 min，按照试剂盒提取总RNA并用Nanodrop 2000 分光光度计检测总RNA 浓度，取1 μg RNA 逆转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR。20 μL 反应总体系，包含10 μmol 上游引物，10 μmol 下游引物，UltraSYBR Mixture，40 ng cDNA模板，ddH2O 补齐至20 μL；使用Light Cycler 96 Real-Time PCR System 进行检测，PCR 程序为：95℃5 min，40 个循环（95℃孵育20 s，60℃孵育20 s，72℃孵育20 s），95 ℃延 伸5 min；数 据 用2-ΔΔCT公式计算，以内源性管家基因β-actin 为内参。PT-qPCR 所用引物如表2。

表2 PCR 扩增目的片段引物序列Tab 2 Primer sequences of PCR amplification target fragments

1.3 统计学处理 应用Prism 软件进行数据分析，所有实验都重复3 次，数据以x±s 表示。多组间相互比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PIM1 过表达促进细胞衰老 Western 印迹实验结果显示，与空载对照组相比，PIM1 组细胞衰老相关蛋白p53、p21 和p16 的表达量显著上调（图1A，p53，t=4.360，P＜0.05；p21，t=3.814，P＜0.05；p16，t=4.720，P＜0.01）。衰老相关β-半乳糖苷酶染色实验结果显示，与空载对照组相比，PIM1 组衰老细胞增加（图1B，t=6.831，P＜0.01）。

图1 PIM1 过表达促进细胞衰老Fig 1 PIM1 overexpression promoted cellular senescence

2.2 PIM1 能有效免疫沉淀hnRNPU 蛋白 免疫沉淀实验结果显示，与空载Control 组相比，PIM1 组在分子量100 kD 的位置存在差异条带（图2A）。将差异条带进行质谱鉴定，结果显示，免疫沉淀物检测到hnRNPU（图2B）。

图2 PIM1 能有效免疫沉淀hnRNPUFig 2 PIM1 effectively immunoprecipitated hnRNPU

2.3 PIM1 过表达下调hnRNPU 蛋白表达 Realtime PCR 实验结果如图3A 所示，与空载对照组相比，PIM1 组hnRNPUmRNA 水平不发生变化（图3A，t=0.295，P=0.783）。Western 印迹实验结果如图3B 所示，与空载对照组相比，PIM1 组hnRNPU 蛋白水平显著下降（图3B，t=33.85，P＜0.001）。

图3 PIM1 过表达下调hnRNPU 表达Fig 3 PIM1 overexpression down-regulated hnRNPU expression

2.4 过表达hnRNPU抑制PIM1诱导的细胞衰老 与PIM1组相比，PIM1+hnRNPU 组衰老相关蛋白p53、p21 和p16 的表达均明显下降（图4A，p53，t =15.317，P＜0.001；p21，t =8.012，P＜0.01；p16，t=14.080，P＜0.001）。衰老相关β-半乳糖苷酶染色实验结果如图4B 所示，与PIM1 组相比，PIM1+hnRNPU 组衰老细胞减少（图4B，t=10.38，P＜0.01）。

图4 过表达hnRNPU 抑制PIM1 诱导的细胞衰老Fig 4 Overexpression of hnRNPU inhibited cellular senescence induced by PIM1

3 讨论

细胞衰老是指细胞脱离细胞周期并不可逆地丧失增殖能力后进入的一种相对稳定的状态。已有研究表明，遗传因素、DNA 损伤、端粒功能异常和癌基因的激活等多种内外刺激都能诱导细胞衰老[13]。衰老细胞的最基本特征是衰老相关β-半乳糖苷酶的表达增加。目前已知与细胞衰老相关的信号通路主要有p16-Rb 通路和p53-p21 通路，其中p21 和p16 是诱导细胞衰老和细胞周期停滞的肿瘤抑制因子[14-15]。细胞衰老可阻止致癌基因激活、遗传不稳定和受损细胞的增殖，是一种重要的肿瘤抑制机制[16]。此外，原癌基因的激活是肿瘤发生、发展的一个关键因素。尽管原癌基因的激活可以刺激细胞增殖，然而原癌基因的激活可诱导细胞发生衰老[17]。原癌基因诱导的细胞衰老使肿瘤停滞在癌前病变的状态，是一种潜在的肿瘤抑制机制。因此，揭示原癌基因诱导衰老的分子机制，有助于人们更加深入了解肿瘤发生的本质，并且在研究过程中可能会发现新靶点，为相关肿瘤的治疗提供新方法。

PIM1 作为一个原癌基因在多种肿瘤中高表达，通过磷酸化多种底物在肿瘤生长、发展中起重要作用。然而，原癌基因PIM1 在细胞衰老的作用有诸多研究报道。研究者发现在细胞复制性衰老和原癌基因诱导的细胞衰老中，IL-6/STAT3 信号通路的激活导致PIM1 的表达显著增加[4]。有研究发现，PIM1 可通过磷酸化异染色质蛋白1（HP1）和高迁移率族盒转录因子1（HBP1），导致基因组不稳定性和抑制衰老相关基因表达发生变化，进而促进细胞衰老[17-18]。此外，笔者前期的文章也发现PIM1 通过磷酸化泛素样含PHD 和环指域1（UHRF1）使其稳定性减弱，导致全基因组DNA 低甲基化，引起基因组不稳定和p16表达量增加，从而诱发细胞衰老。然而，笔者发现过表达UHRF1 并不能完全消除PIM1 诱导的细胞衰老，说明PIM1 还可以通过其他机制诱导细胞衰老[5]。

在本研究中，笔者通过衰老相关蛋白的Western 印迹和衰老相关β-半乳糖苷酶染色实验证实原癌基因PIM1 能促进人胚肺成纤维细胞发生衰老。为了进一步阐明PIM1 诱导细胞衰老的分子机制，笔者寻找能与PIM1 结合的新蛋白，免疫沉淀联合质谱技术结果证实hnRNPU 是PIM1 新的结合蛋白。本研究还发现PIM1 能抑制hnRNPU 蛋白水平表达，而不影响其mRNA 表达水平。这些实验结果提示hnRNPU 可能在PIM1 诱导的细胞衰老中发挥重要作用。

hnRNPU 是一个多功能结构域的核蛋白，可以结合DNA 和RNA，参与多种基因的转录和转录后水平的调控[19]。hnRNPU 功能研究多集中于肿瘤的研究，如hnRNPU 能够促进肝癌的发展，被认为可能是c-Myc 的一个新的转录靶点[20-22]。然而，hnNRPU与细胞衰老的研究甚少，近年来仅有一项研究发现，hnRNPU 和长链非编码RNA PANDA 与多梳蛋白抑制复合体（PRC1 和PRC2）或者转录因子NF-YA 相互作用促进或者抑制细胞衰老[12]。因此，hnRNPU 与细胞衰老的关系还需要研究者进一步探索。

本实验中，笔者通过衰老相关蛋白的Western 印迹和衰老相关β-半乳糖苷酶染色实验发现过表达hnNRPU 能抑制PIM1 诱导的细胞衰老，证实hn－RNPU 在PIM1 诱导的细胞衰老中发挥抑制作用。笔者猜测过表达hnRNPU 可能导致其与抑制衰老相关基因的DNA 或RNA 的结合增加，从而改变抑制衰老相关基因的转录表达，进而抑制PIM1 诱导的细胞衰老，但是这种假设需要实验进一步验证。本研究明确了hnRNPU 在细胞衰老过程中起抑制作用，hnNRPU 的过表达可能使肿瘤细胞出现衰老障碍，进而增加肿瘤的发生风险。因此，针对hnRNPU 的进一步研究可能为肿瘤治疗提供新线索。

综上，本研究发现过表达hnRNPU 抑制原癌基因PIM1 诱导的细胞衰老，对探究原癌基因诱导细胞衰老的分子机制提供了一种新思路。hnRNPU 可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。