利拉鲁肽对糖尿病肾病大鼠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3表达的影响

马秀琦,薛君,张莹,武学慧,张雅楠,蔡志杰,闫锐晶

(1内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古自治区 包头 014040;2内蒙古包钢医院老年病科,内蒙古自治区 包头 014010)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)和终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的最常见原因,并且与增加心血管疾病发病率和死亡率的风险直接相关[1]。作为糖尿病最严重的微血管并发症之一,DN是一种由多种炎症因子介导的代谢性疾病,高血糖、脂质代谢紊乱、氧化应激、晚期糖基化终末产物等多种因素贯穿于疾病的整个进程[2]。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体被认为是调控炎症产生的分子开关。NLRP3炎症小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific protease-1,caspase-1)组成,激活的NLRP3炎症小体可以通过裂解caspase-1分泌成熟白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)和IL-1β等多种炎症因子产生炎症级联反应[3]。

利拉鲁肽是一种长效的胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide,GLP-1)受体激动剂。研究发现,利拉鲁肽除具有良好的降血糖作用,还具有抗氧化应激和减轻机体炎症的作用[4]。GLP-1可以调节肾脏和血管多个部位的炎症,还可以激活环磷酸腺苷-蛋白激酶A(cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A,cAMP-PKA)通路,保护肾脏免受炎症损伤[5]。本研究旨在观察利拉鲁肽调节NLRP3炎症小体与肾脏保护作用的关系,以期为临床治疗DKD提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象与试剂

1.1.1 实验动物 4周龄健康雄性Wistar大鼠(SPF级),体质量180～200g,购自北京斯贝福生物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2019-0010,饲养于环境温度恒定为(22±2)℃,湿度为50%～60%的动物房中,定期更换垫料,自由饮水及进食。

1.1.2 主要试剂 链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)购自索莱宝生物科技有限公司;利拉鲁肽购自诺和诺德公司;血清肌酐(serum creatinine,SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、尿总蛋白定量(urine total protein,UTP)、血清总胆固醇(total cholesterol,TC)和血清甘油三酯(triglyceride,TG)测定试剂盒购自南京建成生物技术研究所;IL-18和IL-1β酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)试剂盒购自江苏泽雨生物技术有限公司;NLRP3、ASC、caspase-1一抗、羊抗兔二抗均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DN大鼠模型建立及分组 22只健康雄性Wistar大鼠,采用单纯随机抽样方法分为正常对照组(n=6)和糖尿病肾病组(n=16),正常对照组大鼠给予普通饲料喂养,糖尿病肾病组大鼠给予高糖高脂饲料喂养。喂养4周后糖尿病肾病组大鼠禁食不禁水12h,次日清晨称体质量,腹腔注射现配的STZ 30mg/kg溶液,72h后尾静脉取血测量大鼠随机血糖,3次随机血糖≥16.7mmol/L,即糖尿病大鼠模型成功。继续予高糖高脂饲料喂养12周,将大鼠分别置于代谢笼内收集各组大鼠24h尿液,尿蛋白>20mg即视为糖尿病肾病大鼠模型成功建立。将造模成功的大鼠随机分为利拉鲁肽组(n=8)和生理盐水组(n=8),利拉鲁肽组大鼠予200μg/(kg·d)利拉鲁肽皮下注射,生理盐水组大鼠予相同体积生理盐水皮下注射,正常对照组大鼠不予任何处理,共治疗4周。

1.2.2 标本获取与保存 每周称量大鼠体质量,每2周尾静脉取血,血糖仪测量大鼠空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)。第4周治疗结束前一天代谢笼收集各组大鼠24h尿液,所有大鼠禁食不禁水12h,以3%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉后开腹,于腹主动脉采血3～5ml,室温下静置15min后离心(3000转/min,15min),取上清液,标记分装后于-80℃冰箱冻存。取出大鼠双侧肾脏,去除包膜及结缔组织,生理盐水充分灌洗,滤纸吸干水分,称重,计算肾指数(双侧肾质量总和/体质量×100%);肾脏组织于矢状面平分为两部分,一部分于4%多聚甲醛固定液中固定24h,常规酒精梯度脱水,石蜡包埋,4μm厚连续切片,苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,中性树胶封片,光学显微镜下观察肾脏组织形态;另一部分分装于冻存管,于-80℃冰箱保存备用。

1.3 观察指标

(1)肾功能测定:血液离心取上清液,严格按照试剂盒说明书操作,测定血清SCr和BUN水平。(2)血脂测定:血液离心取上清液,严格按照试剂盒说明书操作,测定血清TC、TG水平。(3)IL-18和IL-1β水平测定:采用ELISA法检测血清IL-18、IL-1β水平,严格按照实验说明书操作。(4)NLRP3、ASC、caspase-1蛋白的表达:采用Western blot法检测。将0.1g肾脏组织在液氮中研磨至肉眼无可见颗粒,加入500μl蛋白裂解液,冰上充分裂解,离心(离心力146843g,4℃,5min),取上清液。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法进行蛋白浓度测定。进一步行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳,将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene flooride,PVDF)膜上,5%脱脂奶粉封闭1h,TBST洗涤3次,每次10min;分别加入NLRP3、ASC、caspase-1一抗,4℃孵育过夜,TBST洗涤3次,每次10min;加入二抗孵育1h,TBST洗涤3次,每次15min,增强型化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒显色,ImageJ分析NLRP3、ASC、caspase-1蛋白灰度值。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 大鼠一般情况

糖尿病肾病组大鼠精神萎靡,毛发粗糙,颈部毛发出现红棕色,进食、饮水、尿量均增多,垫料味道大且潮湿。利拉鲁肽组2只大鼠血糖不达标,予以剔除,实验期间生理盐水组2只大鼠死亡,可能由于血糖过高所致急性并发症。

2.2 3组大鼠体质量、肾重及肾指数比较

与正常对照组比较,生理盐水组大鼠体质量降低,肾重、肾指数升高,差异均有统计学意义(P<0.01);利拉鲁肽组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05),肾重、肾指数升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与生理盐水组比较,利拉鲁肽组大鼠体质量升高,肾重下降,差异有统计学意义(P<0.01),肾指数差异无统计学意义(P>0.05;表1)。

表1 3组大鼠体质量、肾重及肾指数比较

2.3 3组大鼠SCr、BUN、UTP、TC、TG及血糖水平比较

与正常对照组相比,生理盐水组大鼠FBG、UTP、SCr、BUN、TC、TG明显升高,利拉鲁肽组大鼠FBG、UTP、SCr、BUN明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。与生理盐水组相比,利拉鲁肽组大鼠FBG、UTP、SCr、BUN、TC、TG明显下降,差异均有统计学意义(P<0.01;表2)。

表2 3组大鼠生化指标比较

2.4 3组大鼠IL-1β、IL-18水平比较

结果显示,生理盐水组大鼠血清IL-1β、IL-18水平较正常对照组显著升高;经利拉鲁肽干预后,IL-1β、IL-18水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.01;表3)。

表3 3组大鼠IL-1β与IL-18水平比较

2.5 3组大鼠NLRP3炎症小体蛋白表达情况比较

Western blot检测结果显示,生理盐水组NLRP3蛋白表达量较正常组明显增加,而经过利拉鲁肽干预后,NLRP3蛋白表达量有所下降;生理盐水组凋亡相关斑点样蛋白ASC表达量较正常组明显增加,利拉鲁肽干预后,ASC蛋白表达下降;生理盐水组caspase-1蛋白表达量较正常组明显增加,经过利拉鲁肽的干预,caspase-1蛋白下降。研究结果显示,利拉鲁肽干预可明显改善糖尿病肾病大鼠肾脏组织中NLRP3炎症小体的表达,从而改善糖尿病肾病大鼠疾病的进展(图1)。

2.6 利拉鲁肽对DN大鼠肾脏病理变化的影响

肾组织HE染色光学显微镜下观察显示,与正常对照组相比,生理盐水组出现肾小球体积增大、 结构紊乱,系膜外基质增多,基底膜增厚明显,利拉鲁肽组大鼠肾脏病理变化减轻(图2)。

3 讨 论

糖尿病现已成为一个全球性的健康问题,DN是糖尿病常见的微血管并发症。DN是糖尿病患者发病和死亡的主要原因,其在1型和2型糖尿病患者中患病率分别为30%和50%[6]。目前尚无治疗DN的特异性药物,而现有的治疗效果尚不能令人满意,全球近1/2的DN患者需要肾脏替代治疗[7]。一项荟萃分析提示,GLP-1受体激动剂对2型糖尿病的肾脏结局具有有益影响[8]。本研究使用高糖高脂饮食联合STZ制备DN大鼠模型,观察利拉鲁肽对DN大鼠肾脏功能的保护作用,结果显示持续高血糖状态下,肾小球硬化、肾小管扩张或萎缩、细胞外基质过度蓄积、间质纤维化等各种病理改变,引起肾脏结构及功能上的改变,促进DN的发生与发展。一项临床研究发现,患有3期慢性肾脏病的超重糖尿病患者,经过利拉鲁肽治疗18周后,肾小球滤过率增加,尿白蛋白显著减少[9]。本研究亦发现,利拉鲁肽治疗后,DN大鼠体质量、24h尿量、血脂、血糖均明显降低,SCr、BUN、UTP等生化指标明显改善,然而对DN大鼠摄食量无明显影响,提示利拉鲁肽具有肾脏保护作用。肾脏纤维化是所有CKD的最终途径,它会导致进行性肾损伤,比肾小球损伤更能加快肾功能衰竭,而且目前尚无特异性治疗方法。Xu等[10]研究发现利拉鲁肽通过增加存活因子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)的表达减轻肾细胞凋亡,可有效改善血管平滑肌细胞从合成表型向收缩表型的转化,从而减少高糖环境诱导的肾纤维化。本研究结果显示,DN大鼠肾脏重量增加,肾小球肥大导致肾脏大小和重量增加,是早期DN的形态学标志。肾脏组织HE染色结果显示,利拉鲁肽组大鼠肾脏肾小球形态更规则,肾小管水肿减轻;相反生理盐水组大鼠表现出明显的病理变化,包括肾小球形态不规则,肾小管水肿伴部分坏死,说明利拉鲁肽可对DN发挥保护作用。

图1 3组大鼠 NLRP3炎症小体相关蛋白表达情况比较

图2 3组大鼠肾组织光镜图片

NLRP3炎症小体参与多种慢性肾脏疾病的发生与发展[11]。在DN患者肾组织活检及DN大鼠肾组织中均可以观察到NLRP3炎症小体的激活[12,13]。本研究中,DN组大鼠肾脏组织中NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表达高于正常对照组,血清IL-18和IL-1β水平也显著升高,与Feng等[14]研究结果一致。Fu等[15]研究显示,在体外培养肾小球系膜细胞,经高糖刺激一段时间后,NLRP3和caspase-1蛋白的表达明显增加,并随着刺激时间的延长而增加。Qiu等[16]研究显示,在2型糖尿病患者中,尿白蛋白排泄率与血清和尿液中IL-18的水平之间存在独立相关性,并且血清和尿液中IL-18的水平与蛋白尿的程度呈正相关,表明这些炎症标志物可能是DN发展的独立危险因素。IL-1β水平升高可导致肾近端小管上皮细胞增殖,内皮细胞通透性增加,诱导细胞间黏附因子-1(intercellular adhesion factor-1,ICAM-1)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和钙黏蛋白的表达,影响肾小球血流动力学变化,从而进一步加重肾脏损害。Sakai等[17]研究表明,抑制DN患者体内NLRP3炎症小体的激活和表达可以改善患者的肾功能,延缓肾脏病理变化。NLRP3炎症小体通过诱导IL-1β和IL-18产生将糖尿病肾脏代谢反应与促炎级联反应的激活联系起来。江思瑜等[18]研究发现,利拉鲁肽可以抑制TOLL样受体4/髓样分化初级反应蛋白88(TOLL like receptor 4/myeloid differentiation primary response protein 88,TLR4/MyD88)先天免疫信号转导通路,降低促炎因子的表达,发挥肾脏保护作用。Kawanami等[19]研究发现,利拉鲁肽还可激活环磷酸腺苷-蛋白激酶A(cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A,cAMP-PKA)通路,减少肾脏活性氧的产生,抑制NLRP3炎症小体的激活,进而减轻肾脏内皮细胞炎症所致损伤,同时抑制TGF-β及其下游信号通路,减弱肾小管上皮-间质转化(renal tubular epithelial-mesenchymal transition,EMT),预防和修复肾小管间质纤维化。本研究结果与此一致,经过利拉鲁肽干预后,大鼠肾脏组织中NLRP3炎症小体蛋白表达下降,其下游炎症因子IL-18、IL-1β也下降,说明利拉鲁肽可能抑制了NLRP3炎症小体的激活,从而发挥对DN大鼠肾脏保护作用。

综上,DN中存在NLRP3炎症小体的激活,利拉鲁肽可能通过抑制NLRP3炎症小体的表达,延缓DN的病情进展。NLRP3炎症小体可能成为防治DN的新靶点,未来需要我们深入研究其具体作用机制。