不同花色紫薇花瓣的花色苷化合物组分及含量比较

马晓华, 陈春青, 叶胜忠, 钱仁卷, 郑 坚, 张旭乐

(1.浙江省亚热带作物研究所,浙江 温州 325005;2.温州市资源植物创新利用实验室,浙江 温州 325005;3.平阳县林业技术推广指导和森林资源保护站,浙江 平阳 325400;4.永嘉县森林病虫害防治中心,浙江 永嘉 325100)

花色是观赏植物的重要性状之一,是植物自然进化过程中最具适应意义的表型性状。丰富的花色不仅可以吸引传粉者帮助植物授粉繁殖,也赋予植物多姿多彩的外在表型以满足人类的视觉欣赏需求[1-2]。花色素是构成植物花色的重要物质基础,其成分与含量差异直接影响花的呈色现象[3]。植物花色素主要分为甜菜素、类胡萝卜素和类黄酮三大类。其中,类黄酮是形成丰富花色的决定性色素群[4]。花色苷是类黄酮化合物的主要组成部分,是决定花色的主要色素群,广泛存在于红色、蓝色、紫色的植物花瓣中[5]。花瓣显示出的颜色不仅与花色苷种类密切相关,而且与其含量也密不可分[6]。在花色苷种类与比例相似情况下,总含量不同也会使花色有差异[7]。飞燕草素、矢车菊素、芍药花素、锦葵素、天竺葵素及矮牵牛素等均是自然界中最常见的花色苷[8]。

紫薇(Lagerstroemiaindica)是中国的传统花卉之一,也是园林造景中应用最为广泛的景观植物之一[9]。常见的紫薇花色主要包含鲜红、深红、粉红、紫色及白色等,以红色系为主。林启芳等[10]研究发现,类黄酮代谢途径中产物的积累差异是导致黄薇属与紫薇属植物花色差异的主要原因,但关于紫薇属植物不同花色的成因仍需进一步探索。因此,为明确不同色系紫薇花瓣中花色苷化合物种类及含量,本研究以不同色系的紫薇花瓣为研究材料,采用超高效液相色谱—串联质谱(ultra high performanc eliquid chromatography-mass spectrometer, UPLC-MS/MS)技术对花瓣中的花色苷化合物进行广泛靶向代谢物定性定量分析,并通过主成分分析(PCA)探明不同花色间的差异,以期为紫薇花色的定向改良及特色新品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料与花色比对

参试的紫薇包括:‘屋久岛’紫薇(L.fauriei)、‘苏森’(L.indica‘SIOUX’)、‘乔克托’(L.indica‘CHOCTAW’)、‘美国红火箭’(L.indica‘Red rocket’)、‘紫叶丹红’(L.indica‘Ebony Embers’)和‘四川大日红’(L.indica)(图1)。使用英国皇家园艺学会比色卡(royal horticultural society color card, RHSCC)初步鉴定紫薇花色。在光源充足(非直射光)条件下,对每种紫薇花色比对10次,出现频率最高的花瓣颜色视为花色表型结果[11]。

L1.‘屋久岛’;L2.‘苏森’;L3.‘乔克托’;L4.‘美国红火箭’;L5.‘紫叶丹红’;L6.‘四川大日红’。图1 参试的不同花色紫薇Figure 1 L.indica varieties with different petal colors tested

1.2 花色苷的提取与分析

1.2.1 提取 2021年8月中旬,于温州市景山紫薇苗圃基地(28°23′N,120°72′E)采摘盛花期的紫薇花朵。每个参试紫薇取3个生物重复。经液氮速冻后,将紫薇花朵保存在-80 ℃冰箱。将冷冻后的紫薇花瓣研磨至粉末状,每份称取0.05 g,加 4 mL体积分数为70%的甲醇溶液后摇晃30 s,涡旋2 min,之后超声波震荡30 min,然后于4 ℃下避光浸提24 h,其间间或摇晃几次。 12 000 r·min-1离心 20 min,取1 mL上清液,用0.22 μm微孔滤膜过滤后供上机分析。

1.2.2 组分分析 采用UPLC-MS/MS的方法鉴定紫薇花瓣所含花色苷成分。参照 Li et al[12]的方法,UPLC分析条件如下:色谱柱为Acquity UPLC HSS T3 C18型(1.8孔径,2.1 mm×100 mm);柱温45 ℃,流速0.4 mL·min-1,进样体积2 μL;流动相的A液为体积分数为0.1%甲酸溶液,B液为含0.1%甲酸的乙腈(体积比为99.9∶0.1)。洗脱程序梯度:0 min,水/乙腈(体积比为95︰5);3 min,80︰20;10 min,0︰100;12 min,0︰100;15 min,5︰95;19 min,5︰95。质谱条件为:电喷雾离子源温度为550 ℃,正离子模式下质谱电压为5 500 V,气帘气为241.325 kPa。根据优化后的去簇电压和碰撞能扫描检测每个离子对,并基于由标准品构建的MWDB数据库(Metware database)对质谱检测数据进行定性分析。

1.2.3 含量测定 参考Wang et al[13]的方法对花色苷进行定量分析。采用超高效液相色谱—四级杆飞行时间质谱联用仪(UPLC-Q-TOF-MS) 分析花色苷各组分的相对含量,用MultiaQuant软件进行色谱峰的积分和校正,计算各色谱峰的峰面积内对应物质。

1.3 数据处理

使用Excel 2013和SPSS 19.0软件,对紫薇花色苷含量进行数据统计与单因素方差分析,并绘制主成分分析图;利用GraphPad 8软件和MetaboAnalyst,绘制聚类分析图与柱状图[14]。

2 结果与分析

2.1 参试紫薇的花色表型比较

根据比色卡结果(表1),参试紫薇可分为3个色系,即白色、红色和紫色。其中,‘屋久岛’(L1)为白色系;‘苏森’‘乔克托’‘美国红火箭’及‘紫叶丹红’(L2～L5)均属红色系;‘四川大日红’(L6)则为紫色系(图1)。

表1 参试紫薇的花色分类Table 1 Petal color classification of L.indica varieties tested

2.2 参试紫薇的花色苷总含量比较

将紫薇花瓣提取液上样,经UPLC-MS/MS分离鉴定表明,红色系花瓣总花色苷相对含量显著高于紫色系、白色系花瓣(图2)。其中,深红色‘紫叶丹红’(L5)的花色苷总含量最高,为7 806.33 μg·g-1,显著高于L1、L2和L6;白色的L1最低,为1 125.91 μg·g-1。6个品种花色苷总含量依次为:‘紫叶丹红’(L5)>‘乔克托’(L3)>‘美国红火箭’(L4)>‘苏森’(L2)>‘四川大日红’(L6)>‘屋久岛’(L1)。

L1.‘屋久岛’;L2.‘苏森’;L3.‘乔克托’;L4.‘美国红火箭’;L5.‘紫叶丹红’;L6.‘四川大日红’。不同小写字母表示差异达0.05显著水平。图2 不同花色紫薇花瓣的花色苷总含量比较Figure 2 Comparison of total anthocyanins in L.indica petals with different colors

花色苷按照不同化合物结构分为8类(表2)。其中,白色系紫薇以黄酮类、矢车菊素类及锦葵色素类化合物为主,分别占花色苷总含量的58.16%、26.45%及7.49%;在红色系中,L2与L3所含锦葵色素类化合物比例较高,分别达31.15%和38.49%,而L4、L5与L6主要以飞燕草素类化合物为主,分别占35.01%、45.32%和34.69%。

表2 不同花色紫薇花色苷化合物占花色苷总含量的百分比Table 2 Proportions of different anthocyanin components in L.indica petals with different colors

2.3 参试紫薇花色苷化合物含量聚类热图分析

为更好地比较参试紫薇各单体花色苷组分的积累差异,将鉴定出的59种化合物进行聚类热图分析。如图3所示,基于各单体花色苷化合物含量,可将不同色系样品分为2类,即白色系‘屋久岛’紫薇以及属于红色系、紫色系的其他5个品种。其中,L2和L6、L3和L6均出现聚集情况,说明具有较为相似的花色苷积累模式。此外,大多数单体花色苷化合物以结合糖苷的形式存在。按照花色苷化合物含量的高低,可将其分为3组。第1组包含12种花色苷化合物,分别为:芍药花素-3,5-O-二葡萄糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、锦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-半乳糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、二氢杨梅黄酮、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、芦丁、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和锦葵色素-3-O-葡萄糖苷,在6个紫薇品种中均被检测到且含量较高;第2组中,L5单体花色苷含量高于其他品种;第3组鉴定出的化合物在6个品种花瓣中均为痕量存在。

2.4 参试紫薇花色苷化合物主成分分析

为进一步明确不同花色紫薇花瓣中的主要花色苷化合物,将检测得到的59种花色苷化合物进行主成分分析(图4)。以第1主成分(贡献率67.5%)、第2主成分(贡献率为25.1%)绘制二维散点图及主成分因子载荷图(图4A)。筛选出12种主要花色苷化合物,分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3,5-O-二葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-半乳糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、二氢杨梅黄酮、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(异槲皮苷)、芦丁和山柰酚-3-O-芸香糖苷。同时以该12种花色苷化合物为主成分,可将6个参试品种分为2个类群,即白色系‘屋久岛’(L1-1,L1-2,L1-3)及其他品种(图4B)。

2.5 参试紫薇主要花色苷化合物的含量差异比较

为进一步明确不同花色紫薇的主要花色苷化合物含量差异,选取12种主要成分进行比较。如图5B、5L所示,在红色系品种中,随着花瓣颜色加深,飞燕草素-3-O-葡萄糖苷及山柰酚-3-O-芸香糖苷含量逐渐增加,且在L5中含量最高,分别达3 416.80、69.26 μg·g-1;而矢车菊素-3-O-葡萄糖苷及2种芍药花素类化合物(芍药花素-3-O-葡萄糖苷和芍药花素-3,5-O-二葡萄糖苷)则在L4中最大(图5A、5E、5F)。在图5C、5D、5G、5H中,白色系L1中含有少量的锦葵色素类化合物(锦葵色素-3-O-葡萄糖苷和锦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷)及痕量的矮牵牛素类化合物(矮牵牛素-3-O-半乳糖苷和矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷)。由图5J可见,红色系L2中槲皮素-3-O葡萄糖苷含量显著高于其他紫薇品种。6个品种花瓣的矮牵牛素类化合物积累模式相同(图5G、5H)。

L1.‘屋久岛’;L2.‘苏森’;L3.‘乔克托’;L4.‘美国红火箭’;L5.‘紫叶丹红’;L6.‘四川大日红’。A.矢车菊素-3-O-芍药糖苷;B.飞燕草素-3-O-葡萄糖苷;C.锦葵色素-3-O-葡萄糖苷;D.锦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷;E.芍药花素-3-O-葡萄糖苷;F.芍药花素-3,5-O-二葡萄糖苷;G.矮牵牛素-3-O-半乳糖苷;H.矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷;I.二氢杨梅黄酮;J.槲皮素-3-O-葡萄糖苷;K.芦丁;L.山柰酚-3-O-芸香糖苷。不同小写字母表示差异达0.05显著水平。图5 不同花色紫薇花瓣的主要花色苷化合物含量比较Figure 5 Comparison of main anthocyanin components in L.indica petals with different colors

3 讨论与结论

本研究选取的6个紫薇品种分为白色系、红色系与紫色系(图1),共在花瓣中检测出59种花色苷化合物。其中,红色系花色苷总含量最高,紫色系次之,白色系最低,说明深色系紫薇中花色苷总含量高于浅色系紫薇。这与张洁[15]对不同颜色的12种美国紫薇及5种中国紫薇的研究结果相似,即白色系紫薇中花色苷总含量显著低于其他色系。花瓣显示出的颜色不仅与花色苷种类密切相关,与花色苷含量、比例也密不可分[16-17]。已有研究表明,飞燕草素类化合物多使花瓣呈现蓝紫色,锦葵素类化合物多呈现淡紫色,矢车菊素类化合物多呈现艳红色,芍药素类化合物多呈现橘红色,而天竺葵素类化合物多呈现深红色[18-20]。本研究发现,白色系紫薇以黄酮类化合物为主,占花色苷总含量的58.16%;在红色系中,‘苏森’与‘乔克托’所含锦葵素类化合物比例较高,而‘美国红火箭’‘紫叶丹红’与‘四川大日红’以飞燕草素类化合物为主,分别占35.01%、45.32%和34.69%。以上表明,不同紫薇品种的花色苷成分与其显示出的花色基本相同,且花色苷种类及含量差异是形成不同花色的原因之一。这与玉兰(Magnoliadenudata)[21]、牡丹(Paeoniasuffruticosa)[22]中的研究结果相似,表明花色苷种类及含量影响花色。锦葵色素与矮牵牛素类化合物是花瓣显示红色的重要组分之一,且随着两者含量的增加,花瓣颜色也随之加深。

本研究对紫薇花瓣的59种花色苷化合物进行聚类分析发现,参试紫薇主要分为2组,即白色系‘屋久岛’以及属于红色系、紫色系的其他5个品种,其中‘苏森’和‘四川大日红’、‘乔克托’和‘四川大日红’(图3)均出现聚集情况。进一步进行主成分分析表明,锦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-半乳糖苷和锦葵色素-3-O-葡萄糖苷等在内的12种花色苷化合物是紫薇花瓣中的主要花色苷化合物。‘乔克托’‘美国红火箭’和‘紫叶丹红’红色紫薇花瓣中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药花素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-半乳糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷等显著高于其他紫薇品种,是由于紫薇花色苷合成途径中间产物与终产物含量差异所致[23]。‘屋久岛’紫薇花瓣白色可能与飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷和锦葵色素-3, 5-O-二葡萄糖苷较低有关,推测不同品种紫薇花瓣生物合成花色苷的过程存在差异[24-25]。

综上所述,6个紫薇品种花瓣中共检测出59种花色苷化合物,花色表型分别为白色系、红色系和紫色系;根据各单体花色苷化合物含量,可将不同色系样品分为2类,即白色系‘屋久岛’紫薇以及属于红色系、紫色系的其他5个品种。其中,红色系紫薇花瓣中花色苷总含量较高,以锦葵色素类与矮牵牛素类物质为主,紫色系紫薇花色苷含量次于红色系,以飞燕草素类化合物为主要呈色物质,而白色系紫薇花瓣中花色苷含量较低,以黄酮类化合物为主。本研究结果可为进一步解析紫薇花瓣花色苷生理生化机制与种质资源的定向改良提供初步的理论依据。