肝豆状核变性、非酒精性脂肪性肝病和自身免疫性肝炎儿童肝组织超微结构变化特征*

黄 慧,林 敏,曾桂香

肝豆状核变性,又称为威尔森病(Wilson’s disease,WD),是一种与ATP7B基因突变相关的常染色体隐性铜代谢疾病。ATP7B基因编码跨膜P型ATPase铜转运蛋白(transmembrane P-type ATPase copper transporter,ATP7B)[1]。目前,已经发现有700多种致病的ATP7B变异类型[2]。ATP7B在肝细胞铜蓄积过程中起重要作用[3]。在WD患者,ATP7B基因功能受损会导致铜在人体内异常积累,肝脏受影响最大,其次是脑等其他器官。铜代谢异常主要通过氧化应激和破坏蛋白质结构等诱导细胞凋亡,从而产生细胞毒性[4]。铜会促进活性氧的生成,引起线粒体膜和其他细胞内膜结构的脂质过氧化。此外,过量的铜也会导致细胞内脂质代谢异常。WD的临床表现多种多样,包括肝脏、神经和精神症状等。儿科患者以肝脏症状为主起病[5]。轻症的WD可仅有无症状的血清转氨酶升高,而重症甚至可导致急性肝功能衰竭。在临床诊疗过程中,非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)和自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)也较常见,需要与WD相鉴别。目前,儿童肥胖和NAFLD发病率正在迅速上升。NAFLD已成为美国慢性肝病的最常见的病因[6]。本研究旨在探讨儿童WD、NAFLD和AIH患者肝组织超微结构特征变化,现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2018年12月～2022年2月我院诊治的WD患儿37例,男性20例,女性17例,年龄为8.5～14.0岁,平均年龄为(11.0±2.1)岁;NAFLD患儿20例,男性9例,女性11例,年龄为9.0～12.5岁,平均年龄为(11.0±0.9)岁;AIH患儿17例,男性3例,女性14例,年龄为5.5～14.5岁,平均年龄为(10.0±3.2)岁。WD的诊断符合《中国肝豆状核变性诊治指南》(2021年):存在肝损伤和椎体外系受损表现,角膜K-F环阳性,血清铜蓝蛋白水平下降,24 h尿铜升高,影像学检查表现符合WD;NAFLD的诊断符合《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)》的标准,超声检查至少符合以下两项:肝脏近场回声弥漫性增强(“明亮肝”),且回声强于肾脏,肝脏远场回声逐渐衰减,肝内管道结构显示不清;AIH的诊断符合1998年国际自身免疫性肝炎小组修订的《自身免疫性肝炎描述性诊断标准及评分诊断标准》,即AIH诊断评分大于或等于12分,血清IgG、IgM和IgA水平异常升高,肝组织出现淋巴细胞、浆细胞浸润和玫瑰花环样结构,无HBV或HCV感染证据。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 肝活检 使用美国Bard公司提供的MG-1522型全自动活检枪,在超声引导下穿刺获取肝组织,长度约为1.5～2.0 cm。一部分肝组织经4% 甲醛溶液固定、 75%～100%乙醇梯度脱水,石蜡包埋后,4μm连续切片,行常规HE染色,在日本Olympus公司提供的BX53型光学显微镜下观察。将另一部分肝组织置于4℃,经2.5%戊二醛固定,再4℃、1%锇酸固定,经乙醇和丙酮脱水,用环氧树脂包埋,制成1μm厚的半薄片,使用钻石刀切制成70 nm厚的超薄切片,经铀铅染色,使用日本JEOL公司提供的JEM-1200EX型透射电镜观察。

2 结果

2.1 三组肝组织学表现比较 WD组纤维化和铜染色阳性占比显著高于NAFLD组,而巨泡状脂肪变性和小脂滴比例显著低于NAFLD组;WD组肝组织巨泡状脂肪变性、小脂滴和肝细胞核空泡样变比例显著高于AIH组,而门脉炎症、界面性肝炎、小叶内炎症、浆细胞浸润(>30%)和肝细胞玫瑰花样结构比例显著低于AIH组,差异具有统计学意义(P<0.05,表1)。

表1 三组肝组织学表现(%)比较

2.2 三组肝组织超微结构特征比较 WD组线粒体多形性、嵴尖端扩张、膜复制和基质密度增高比例显著高于NAFLD组或AIH组,而夹杂准晶体比例显著低于NAFLD组(P<0.05,表2)。

表2 三组肝组织超微结构表现特征(%)比较

3 讨论

在本研究,我们评估了儿童WD患者肝组织超微结构特征,并与年龄相匹配的NAFLD和AIH患儿进行了比较。这三种临床上重要的肝病有重叠的临床表现,但它们治疗方法有所不同[7]。在基层医疗单位,由于WD病例不常见,诊治经验少,诊断儿童WD具有很大的挑战性。研究儿童肝病患者肝组织学表现特征对于理解临床表现可能有帮助。我们的研究表明,大多数儿童WD患者在超微结构上都有线粒体形态结构的改变,包括线粒体嵴尖端扩张、多形性、膜复制和基质密度增高。本研究在光镜下观察肝组织学特征表明,这三种疾病之间存在广泛的病理学表现重叠。通常,儿童WD在组织学上表现也有脂肪变性或脂肪性肝炎,是其与NAFLD的鉴别诊断带来了挑战。因此,熟悉各种疾病的临床特点,并结合组织病理学特征区分WD与NAFLD的必要性[8]。几乎所有的NAFLD病例都有巨泡状脂肪变性,而相比之下,只有3例WD患者发现局灶性微泡状脂肪变性。之前也有研究证明了这个发现,即微泡状脂肪变性在WD患者并不是典型的特征[9],但偶尔可能与巨泡状脂肪变性同时存在。在大多数WD和AIH病例都观察到了一定程度的肝纤维化,表明肝纤维化仅仅是疾病进展的一个特征,而不是区分WD与AIH的有效指标。由于儿童NAFLD以脂肪变为主,肝组织炎症和纤维化还相对少见。此外,根据经验,铜染色不能用于诊断或排除WD[10]。在本研究,只有29.7%WD和23.5%AIH患者肝组织铜染色阳性。本组WD和AIH患儿还存在肝纤维化表现。如果不加以干预,可能会导致肝功能进一步损伤和肝硬化。众所周知,在WD的早期阶段,肝细胞中铜还没有大量积聚在溶酶体中,因此还不能被现有的组织化学染色技术所识别。

WD患者肝组织线粒体功能的异常与铜超载有直接的关系。铜的排泄障碍会导致铜的异常蓄积,从而导致大量自由基生产和严重的氧化应激,进而对肝细胞造成损伤[11]。线粒体对氧化应激非常敏感。已有研究表明,相比于光镜下观察到的组织学改变,在超微结构上线粒体的改变可以更早被观察到。有研究发现,小鼠肝细胞线粒体结构的早期典型改变比其他组织学改变出现的时间更早[12]。在WD患者肝组织,电子传递链上复合体IV(细胞色素C氧化酶)减少是早期线粒体损伤的显著特征[13]。心磷脂对线粒体膜的完整性和维持起着至关重要的作用,影响线粒体膜的通透性[14]。心磷脂的氧化损伤会导致线粒体大小和形状的变化(即多形性),线粒体基质密度增高,从而导致膜复制和嵴尖扩张[15]。从受损的线粒体中释放的细胞色素C会激活细胞凋亡途径,下调胆固醇的生物合成,从而导致脂肪变性。在患有肝脏脂肪变性、脂肪性肝炎或明显的AIH儿童,有效地识别WD十分关键[16]。本研究表明,对肝细胞超微结构的观察评估可以有助于在这类患者中识别WD。

我们认识到,目前使用电子显微镜观察诊断还不能普及,部分原因是所需的设备比较昂贵,要求的技能比较苛刻[17]。通过测量肝脏活检样本中铜浓度或检测ATP7B基因,在一定程度上可以有效地诊断WD,但是在儿科实践中,这些方法可能并没有那么容易做到[18]。如果肝组织取样不足,则无法有效检测肝组织实质中的铜浓度,而儿童肝脏活检所获得的样本量往往少于检测铜浓度所需的组织样本量[19]。同样,通过基因分型来诊断WD也有一定的障碍[20]。因此,肝组织超微结构检查提供的信息对于儿童WD的诊断可能非常关键。

综上所述,光镜下观察WD、NAFLD和AIH儿童肝组织病变有相当大的重叠,而肝组织超微结构表现对鉴别WD与NAFLD和AIH非常重要,在儿科工作实践中,在可能的情况下可以考虑开展肝脏超微结构检查,以帮助评估诊断和病情变化。一般认为,由于NAFLD儿童有明显的临床特征变化,如肥胖、超重、血清酶学升高和常规影像学检查的变化,诊断不难。WD不常见,诊断需要高技术手段,治疗时间长,管理较困难,因此需要特别关注。儿童AIH发病相对更低,早期表现更隐匿,诊断需要临床医生想到并进行必要的血清抗体检测。肝组织学检查也有助于评估病情严重程度和治疗应答,都需要认真开展和随访。