南蛇藤提取物通过PDCD5对异位子宫内膜细胞增殖和凋亡的影响

许素娥,徐迪,郭爱香

子宫内膜异位症是临床常见的妇科疾病,与育龄妇女月经不调、痛经、慢性盆腔疼痛等有关,子宫内膜是子宫内壁的组成部分,与雌、孕激素有关,可随月经周期等发生变化[1]。据统计,育龄妇女中约有10%～15%患有子宫内膜异位症,是一种复杂综合征,主要特征是依赖雌激素的慢性炎症[2]。有研究发现,异位子宫内膜细胞恶性增殖和抗凋亡降低是子宫内膜异位症的主要病理机制,也是导致子宫内膜容受性下降、不易怀孕的原因[3-4]。南蛇藤是卫矛科南蛇藤属植物,其根、茎、叶、果均可入药,具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化等多种药理活性[5]。有研究显示,南蛇藤提取物抗肿瘤作用明显,如可以抑制宫颈癌细胞增殖和促进其凋亡[6],但是其在子宫内膜异位症中的研究尚不明确。程序性细胞死亡因子5(programmed cell death factor 5,PDCD5)与肿瘤等疾病发展密切相关,有研究显示,PDCD5在子宫内膜异位症患者在位内膜细胞内低表达,下调PDCD5能够抑制异位内膜间质细胞凋亡和促进细胞增殖[7]。目前多数研究涉及南蛇藤提取物在肿瘤中的作用机制,但尚未有研究报道其应用于临床的方案和指导。基于此,本研究通过体外培养分离人异位子宫内膜细胞,探讨南蛇藤提取物可能通过调控PDCD5对人异位子宫内膜细胞增殖和凋亡的影响,以期为临床应用南蛇藤提取物治疗子宫内膜异位症提供更多循证支持。

1 材料方法

1.1 药物和主要试剂

南蛇藤购于广州致信药业;将南蛇藤茎粉碎成粉,称取适量样品,加入95%乙醇溶液150 L,回流提取3次,每次180 min,回收乙醇,加水分散浸膏,加入石油醚、乙酸乙酯进行萃取,重复3次,用水冲洗后,真空压缩获得南蛇藤乙酸乙酯提取物。加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)试剂稀释调整成50 mg/L,用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,在4℃下保存备用。

Ⅰ型胶原酶购于上海百赛生物;DMSO购于美国Sigma公司;胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶购于美国Gibco公司;LipofectamineTM2000转染试剂盒、TRIzol试剂盒购于美国Invitrogen公司;si-NC、si-PDCD5、引物由上海生工生物设计完成;MTT试剂盒、凋亡试剂盒购于上海贝博生物;p21抗体、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗体、PDCD5抗体、GAPDH抗体购于上海煊翎生物;二抗购于武汉博士德公司;逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒购于美国Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 选取在荷泽市中医医院治疗并进行腹腔镜手术、病理检测为子宫内膜异位症的5例患者,患者在术前3个月内没有服用任何激素药物,手术切除的异位子宫内膜组织置于冻存管内放入液氮罐转运,保存至超低温冰箱。本研究获得了本院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。

1.2.2 分离培养人异位子宫内膜细胞 参照文献[8]:分离培养人异位子宫内膜细胞(human ectopic endometrial cells,HEEC),采用PBS冲洗干净异位子宫内膜组织,去掉血渍,将其剪碎成1 cm3大小,然后加入1.5 mL的胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶于室温下消化60 min,经过100目过筛,除去未消化的组织,然后经过1 000 r/min离心10 min,收集上清液。将分离获得的细胞接种在培养皿内,加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基,放在37℃、5%体积分数的CO2培养箱内培养。观察细胞生长状态,待传代培养细胞稳定后用于后续实验。

1.2.3 细胞分组 取HEEC细胞分别用0、20、40、80 μg/mL南蛇藤提取物处理,记为南蛇藤提取物各剂量组,其中南蛇藤提取物0 μg/mL组用DMSO处理,为对照组;按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书将pcDNA、pcDNA-PDCD5转染细胞中,记为pcDNA组、pcDNA-PDCD5组;将si-NC、si-PDCD5转染至细胞内,用80 μg/mL的南蛇藤提取物处理细胞,记为南蛇藤提取物+si-NC组和南蛇藤提取物+si-PDCD5组。

1.2.4 MTT检测细胞增殖 取经过处理的各组HEEC细胞并接种至96孔板中,每孔接种3×105个,分别培养48 h、72 h后,加入20 μL的MTT试剂,继续培养48 h,然后再加入150 μL的DMSO试剂,低速震荡至结晶溶解,酶标仪490 nm处检测细胞光密度OD值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 取经过处理的各组HEEC细胞并接种至6孔板内,每孔接种2×105个,培养48 h,冲洗细胞并制备单细胞悬液,根据凋亡试剂盒说明书,取5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI与细胞悬液混匀,暗室反应15 min,置于流式细胞仪上检测细胞凋亡的变化。

1.2.6 Western blot检测p21、Bcl-2、Bax、PDCD5蛋白表达 用RIPA裂解各组HEEC细胞获得细胞的总蛋白,根据BCA法检测定量蛋白浓度,然后经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳处理,将蛋白转移至PVDF膜上,采用5%脱脂奶粉封闭培养1 h。加入一抗p21(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、PDCD5(1∶500)和GAPDH(1∶1 000),4℃过夜培养,加入带有标记的二抗(1∶2 000)于37℃培养1 h,在膜上滴加化学发光试剂显影、曝光,采用Quantity One软件分析处理胶片,以GAPDH为内参,分析目的蛋白的表达。

1.2.7 RT-qPCR检测PDCD5 mRNA的表达量 用TRIzol试剂提取各组HEEC细胞内总RNA,在酶标仪A260/A280处检测RNA浓度和纯度,且比值在1.8～2.0之间。利用逆转录试剂盒进行逆转录反应合成cDNA,配置反应体系0.5 μLcDNA、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、5 μL SYBR、3.5 μL无酶水,然后进行PCR扩增反应。以GAPDH为内参,用2-ΔΔCt公式计算PDCD5mRNA的表达量。PDCD5正向引物为5′-ACAGATGGCAAGATATGGACA-3′,下游引物为5′-TCCTAGACTTGTTCCGTTAAG-3′。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度南蛇藤提取物对HEEC细胞增殖的影响

MTT和Western blot实验结果显示,南蛇藤提取物各剂量组的细胞OD值(48 h、72 h)显著降低,p21蛋白表达显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1和图1。

表1 不同浓度南蛇藤提取物对HEEC细胞增殖的影响

图1 不同浓度南蛇藤提取物对HEEC细胞p21蛋白的影响

2.2 不同浓度南蛇藤提取物对HEEC细胞凋亡的影响

流式细胞术和Western blot实验结果显示,南蛇藤提取物各剂量组的细胞凋亡率显著增加,Bcl-2蛋白表达显著降低,Bax蛋白表达显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表2和下页图2。

图2 不同浓度南蛇藤提取物对HEEC细胞凋亡的影响

表2 不同浓度南蛇藤提取物对HEEC细胞凋亡的影响

2.3 不同浓度南蛇藤提取物对HEEC细胞内PDCD5表达的影响

RT-qPCR和Western blot实验结果显示,南蛇藤提取物各剂量组的PDCD5 mRNA和蛋白表达显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。见下页表3和图3。

图3 不同浓度南蛇藤提取物对HEEC细胞内PDCD5蛋白表达的影响

表3 不同浓度南蛇藤提取物对HEEC细胞内PDCD5表达的影响

2.4 过表达PDCD5对HEEC细胞增殖、凋亡的影响

与pcDNA组相比,pcDNA-PDCD5组的PDCD5 mRNA和蛋白表达显著增加,OD值显著降低,细胞凋亡率显著增加,p21、Bax蛋白表达显著增加,Bcl-2蛋白表达显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。见下页表4和图4。

图4 过表达PDCD5对HEEC细胞增殖、凋亡的影响

表4 过表达PDCD5对HEEC细胞增殖、凋亡的影响

2.5 南蛇藤提取物通过PDCD5对HEEC细胞增殖、凋亡的影响

与南蛇藤提取物+si-NC组相比,南蛇藤提取物+si-PDCD5组的PDCD5 mRNA和蛋白表达显著降低,OD值显著增加,细胞凋亡率显著降低,p21、Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.05)。见下页表5和75页图5。

图5 南蛇藤提取物通过PDCD5对HEEC细胞增殖、凋亡的影响

表5 南蛇藤提取物通过PDCD5对HEEC细胞增殖、凋亡的影响

3 讨论

中医学认为子宫内膜异位症的发病机制是“血瘀”,气血失调、郁怒伤肝、脏腑失调等引起血行迟滞、气机不畅[9]。南蛇藤是中国传统中药,具有活血消肿、清热解毒、祛风等功效,民间常用于治疗类风湿关节炎、牙痛、闭经、跌打损伤等疾病[10-11]。南蛇藤化学成分含量丰富,有萜类、黄酮类、醇类等活性成分,对癌细胞有抑制增殖和促进其凋亡的作用[12-13]。有研究结果显示,南蛇藤提取物能抑制胃癌细胞的增殖和促进细胞凋亡,上调Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,呈浓度依赖性[14]。

在食管鳞癌研究中,南蛇藤提取物呈剂量效应抑制食管鳞癌细胞的增殖,并诱导细胞的凋亡[15]。以上均说明南蛇藤提取物对肿瘤的抑制作用,但尚不清楚其在子宫内膜异位症中的作用。因此,本研究选取不同浓度的南蛇藤提取物处理人异位子宫内膜细胞,用于探讨南蛇藤提取物对人异位子宫内膜细胞增殖和凋亡的作用,结果显示,南蛇藤提取物呈剂量依赖性降低人异位内膜细胞的OD值,促进细胞的凋亡,上调p21、Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,说明南蛇藤提取物可能通过增加p21、Bax蛋白表达及降低Bcl-2蛋白表达对人异位子宫内膜细胞起到抑制增殖和促进凋亡的作用。

PDCD5位于染色体19q12～q13区域,是凋亡相关基因的成员之一,分布较为广泛,在多种癌细胞内低表达,如肺癌、结直肠癌、卵巢癌等[16]。Li PH等[17]研究结果显示,PDCD5在白血病细胞系内表达下调,过表达PDCD5能抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,p53、Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调。Gao M等[18]研究结果显示,在高分化子宫内膜癌细胞内PDCD5蛋白表达下调,与肿瘤的分化程度密切相关。PDCD5蛋白在子宫内膜异位症中低表达,与癌症分期显著相关,提示PDCD5与子宫内膜异位症密切相关[19]。本研究显示,采用不同浓度的南蛇藤提取物处理人异位内膜细胞后,PDCD5 mRNA和蛋白表达剂量依赖性上升,实验结果进一步显示,过表达PDCD5能抑制人异位子宫内膜细胞增殖和诱导凋亡,将si-PDCD5转染至人异位子宫内膜细胞后会增加南蛇藤提取物组的细胞OD值,降低细胞凋亡率,下调p21、Bax蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达,提示南蛇藤提取物可能通过调控PDCD5的表达影响人异位子宫内膜细胞增殖和凋亡。

综上所述,南蛇藤提取物可能通过上调PDCD5表达抑制人异位子宫内膜细胞增殖,促进细胞凋亡。PDCD5是凋亡相关基因,在多种癌细胞内低表达,过表达PDCD5可能通过增加p21、Bax蛋白表达及降低Bcl-2蛋白表达,来抑制人异位子宫内膜细胞增殖,促进细胞凋亡。本研究为进一步明确南蛇藤提取物对人异位子宫内膜细胞增殖和凋亡的影响,延缓子宫内膜异位症病情发生发展提供潜在治疗靶点。