牡蛎共生菌Talaromyces sp.ML-3发酵液的化学成分研究

薛亚伟, 孙 丽, 韩 旭, 袁 梦, 王凤舞, 申 丽

(1.扬州大学医学院,江苏扬州 225001; 2.江苏省中西医结合老年病防治重点实验室,江苏扬州 225001;3.青岛农业大学食品科学与工程学院,山东青岛 266109)

海洋——生命的起源之母,覆盖了70%以上的地球表面和90%以上的生物圈。高盐、高渗、低温、低氧、低光照、寡营养的海洋极端环境,促使海洋生物必须调整自身的生存适应机制来应对环境压力,从而形成独特的代谢系统。因此,海洋生物次生代谢产物表现出陆地环境中未发现的新颖结构和化学特征,这些独特的次生代谢产物就是海洋生物作为新药药源的重要基础[1-2]。相较于海洋动植物资源的有限性,海洋微生物种类繁多、数量庞大,随着海洋微生物培养和提取新技术的发展,人们对海洋微生物天然产物的兴趣与日俱增,促进了对海洋微生物来源农用和医用化合物的探索[3-4]。

目前,研究较多的海洋微生物主要有海洋无脊椎动物共附生微生物、海洋植物内生微生物、深海沉积物和海水来源微生物[5]。前期研究中,董玉洁等从长岛海域的牡蛎中分离得到多株共生真菌和细菌[6],本研究对其中的共生真菌——篮状菌(Talaromycessp.)ML-3的化学成分进行研究。综合运用各种层析方法对Talaromycessp.ML-3发酵液的化学成分进行分离纯化,并采用全球天然产物(GNPS)分子网络分析发酵液的化学成分,以期为后续研究中实现化合物的导向分离、挖掘发现新的和/或具有活性的化合物提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柱层析硅胶(200～300目),青岛海洋化工厂分厂;Silica gel 60 F254铝板(20 cm×20 cm),德国Merck公司;Sephadex LH-20,瑞典Pharmacia Biotech公司;Betasil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)和Sinochrom ODS-AP色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),大连依利特分析仪器有限公司;Atlantis T3色谱柱(2.1 mm×100 mm,3 μm),美国安捷伦科技有限公司;DMSO-d6,美国Cambridge Isotope Laboratories;CDCl3,美国Aldrich公司;CD3OD,青岛腾龙微波技术有限公司;色谱甲醇,瑞典欧森巴克环保化学公司;色谱甲酸,美国ACS恩科化学公司;Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、PCRTaqMaster Mix 试剂盒和SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;DreamTaqDNA Polymerase,美国Thermo Scientific公司;其他试剂为分析纯。

1.2 主要仪器

DD2 400核磁共振波谱仪,美国安捷伦科技有限公司;JEOL 500核磁共振仪,日本电子株式会社;TripleTOF 4 600超高效液相色谱仪-四级杆串联飞行时间质谱,美国AB SCIEX有限公司;LC 3000N高效液相色谱仪,北京创新通恒色谱技术有限公司;Isolera one快速纯化制备液相色谱,瑞典Biotage公司;SKY-200B恒温振荡摇床,上海苏坤实业有限公司;SHP-250恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司;Applied Biosystems 2720 PCR仪,赛默飞世尔科技有限公司等。

1.3 试验方法

1.3.1 试验菌株 菌株ML-3是青岛农业大学王凤舞博士于2010年9月从黄渤海交界(长岛)海域采集的牡蛎中分离得到的1株共生真菌,菌株的分离和纯化参照文献[7]中的方法进行。牡蛎共生菌ML-3现保存于扬州大学医学院。

1.3.2 菌株的鉴定 菌株接种至PD培养基中培养3～5 d,按照试剂盒说明书提取DNA。采用通用引物扩增菌株的内转录间隔区(ITS)rDNA序列,扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测得ITS序列上传至GenBank中进行Blast比对分析,用MEGA 7软件构建系统发育树。

1.3.3 菌株发酵和发酵产物的分离纯化 采用真菌1号培养基进行液体发酵,菌株接种至PDA培养基上28 ℃培养2～3 d,将新鲜菌体接种至装有 200 mL PD培养基的500 mL锥形瓶中,摇床28 ℃、120 r/min 培养3 d;种子液以每瓶5～10 mL接种量接种至1 000 mL锥形瓶(400 mL培养基)中,室温静置培养28 d。发酵液经等体积乙酸乙酯萃取3次、减压去除溶剂得到粗浸膏44 g。该粗浸膏经硅胶柱层析,CH2Cl2-CH3OH梯度洗脱(体积比为 100∶0→0∶100)得到15个组分(Fr.1～Fr.15)。组分Fr.5经硅胶柱层析,CH2Cl2-CH3OH梯度洗脱(体积比为 100∶0→0∶100)得到Fr.5-2,经Sephadex LH-20 凝胶柱层析(CHCl3∶CH3OH 体积比为 1∶1)得到Fr.5-2-1～Fr.5-2-3。其中,Fr.5-2-2经硅胶柱层析,石油醚-丙酮梯度洗脱(体积比为 100∶0→0∶100)得到Fr.5-2-2-3,经高效液相色谱(HPLC)[Betasil C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),CH3OH∶H2O 体积比为 78∶22,1 mL/min]纯化得到化合物4(0.6 mg,tR=27 min)。组分Fr.6经硅胶柱层析,CH2Cl2-CH3OH梯度洗脱(体积比为 100∶0→0∶100)得到Fr.6-2,经Sephadex LH-20凝胶柱层析(CHCl3∶CH3OH 体积比为 1∶1),得到Fr.6-2-1～Fr.6-2-4。Fr.6-2-2经HPLC[Sinochrom ODS-AP 柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),CH3OH∶H2O 体积比为 25∶75,1 mL/min]纯化得到化合物2(0.5 mg,tR=28 min);Fr.6-2-3经HPLC[Sinochrom ODS-AP 柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),CH3OH∶H2O 体积比为 70∶30,1 mL/min]纯化得到化合物1(2 mg,tR=25 min)。组分Fr.10经硅胶柱层析,CH2Cl2-CH3OH梯度洗脱(体积比为 100∶0→0∶100)得到Fr.10-1～Fr.10-3,其中,Fr.10-2经Sephadex LH-20凝胶柱层析(CHCl3∶CH3OH 体积比为 1∶1)得到Fr.10-2-2,经HPLC[Betasil C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),CH3OH∶H2O 体积比为 48∶52,1 mL/min]纯化得到化合物3(1.5 mg,tR=45 min)。

1.3.4 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定 (1)高效液相色谱条件:Atlantis T3色谱柱(2.1 mm×100 mm,3 μm);流动相A(0.1%甲酸水溶液),流动相B(甲醇),梯度洗脱(0～5 min,70%→40% A;5～15 min,40%→15% A;15～20 min,15%→1% A);0.3 mL/min;40 ℃;进样量5 μL。(2)四级杆串联飞行时间质谱条件:全扫描模式;气帘气压力 35 kV;雾化温度550 ℃;雾化气 379.2 kPa;喷雾电压5 500 V;去簇电压80 eV;碰撞电压35 eV;一级母离子扫描范围[质荷比(m/z)]为100～2 000;二级子离子扫描范围m/z50～2 000。

1.3.5 特征峰分子网络构建 原始质谱数据文件经MSconvert软件转换成.mzXML格式文件,再经MZmine 2软件处理后以.csv和.mgf格式导出,并上传至GNPS分子网络平台Feature Networking模块构建特征峰分子网络(feature based molecular networking,FBMN)。具体参数设置:前体离子质量误差值0.02 u,碎片离子质量误差值0.02 u,特征峰分子网络内节点间碎片匹配峰≥4个,节点之间的相关余弦值≥0.6。生成的FBMN导入Cytoscape软件进行可视化。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

菌株ML-3的ITS rDNA序列经PCR扩增后测序,测得的ITS序列上传至GenBank中进行Blast比对分析(GenBank登录号:ON005440),构建系统发育树。由图1可知,菌株ML-3被鉴定为Talaromycessp.。

2.2 化合物的结构鉴定

由图2可知,化合物1:黄色粉末;高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)m/z271.060 5[M+H]+和m/z269.046 6[M-H]-,分子式为C15H10O5(C15H11O5计算值为 271.060 1);1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.51(1H,s,H-5),7.02(1H,s,H-7),7.01(1H,d,J=2.4 Hz,H-4),6.19(1H,d,J=2.4 Hz,H-2),2.40(3H,s,H-11)。以上1H-NMR数据与文献[8]中的报道一致,故化合物1被鉴定为大黄素(emodin)。

化合物2:棕色固体;HR-ESI-MSm/z162.093 9[M+H]+和m/z184.074 1[M+Na]+,分子式为C10H11NO(C10H12NO计算值为 162.091 3);1H-NMR(CDCl3,400 MHz)δ:8.03(1H,br s,1-NH),7.63(1H,d,J=8.0 Hz,H-4),7.38(1H,d,J=8.0 Hz,H-7),7.22(1H,t,J=7.6 Hz,H-6),7.13(1H,t,J=7.6 Hz,H-5),7.10(1H,s,H-2),3.92(2H,t,J=6.0 Hz,H-9),3.05(2H,t,J=6.0 Hz,H-8)。以上1H-NMR数据与文献[9]中的报道一致,故化合物2被鉴定为3-indolethanol。

化合物3:橙黄色粉末;HR-ESI-MSm/z287.054 2[M+H]+和m/z309.035 6[M+Na]+,分子式为C15H10O6(C15H11O6计算值为287.055 0);1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:12.37(1H,s,1-OH),12.20(1H,s,8-OH),7.64(1H,s,H-5),7.23(1H,s,H-7),7.01(1H,s,H-4),6.38(1H,s,H-2),5.54(1H,s,11-OH),4.60(2H,d,J=2.0 Hz,H-11)。以上1H-NMR数据与文献[8]和[10]中的报道基本一致,故化合物3被鉴定为 ω-hydroxy-emodin。

化合物4:棕色固体;HR-ESI-MSm/z425.303 0[M+H]+和m/z447.285 8[M+Na]+,分子式为C28H40O3(C28H40NaO3计算值为447.287 0);1H-NMR(CDCl3,500 MHz)δ:6.36(1H,s,H-4),5.27(2H,m,H-22,H-23),2.81(1H,t,J=8.9 Hz,H-9),2.65(1H,d,J=16.7 Hz,H-7a),2.44～2.53(6H,m,H-2ab,H-7b,H-16ab,H-20),1.97～2.06(4H,m,H-1ab,H-11a,H-12a),1.83～1.92(2H,m,H-11b,H-24),1.68～1.78(3H,m,H-12b,H-15ab),1.43～1.51(2H,H-17,H-25),1.27(3H,s,H-19),1.09(3H,d,H-21),0.98(3H,s,H-18),0.91(3H,d,H-28),0.83(3H,d,H-27),0.81(3H,d,H-26)。以上1H-NMR 数据与文献[11]中的报道基本一致,故化合物4被鉴定为(22E,24R)-8,14-epoxyergosta-4,22-diene-3,6-dione。

2.3 Talaromyces sp.ML-3发酵液粗浸膏的特征峰分子网络分析

由图3可知,Talaromycessp.ML-3发酵液粗浸膏和“种子”化合物1～化合物4共同构建的特征峰分子网络图中已标出4个“种子”化合物。该特征峰分子网络(FBMN)共有1 149个节点,并形成862个节点簇(节点数 ≥ 3个的节点簇有24个)。其中,有7个节点簇节点分子的相对含量较高,最高的是2个单节点簇,为303.229 6和317.245 3。利用GNPS平台的Library Search功能进行搜库,结果表明,节点簇A存在脂肪酸类化合物,节点簇B存在二蒽醌类化合物,节点簇C存在单蒽核蒽醌类化合物,节点簇D存在环二肽类化合物,节点簇E存在香豆素类化合物。尽管化合物1和化合物3皆为单蒽核蒽醌类化合物,但2个化合物并未形成同一个节点簇,马小翔等利用GNPS分子网络分析土曲霉C23-3次生代谢产物时也出现类似现象[12]。此外,2个单节点簇303.229 6和317.245 3的二级质谱皆只有一个信号,无法预测其结构类型。

依据GNPS平台的搜库结果以及“种子”化合物,进一步仔细分析上述节点簇中节点分子的二级质谱,对节点分子的化学结构进行鉴定。由图4可知,节点簇A中,节点295.263 8([M+H-H2O]+)的二级质谱与GNPS光谱库数据一致,故将其鉴定为methyl 12-hydroxy-9-octadecenoate(化合物5),在此基础上,推测节点281.247 7([M+H-H2O]+)和297.279 0([M+H-H2O]+)分别为12-hydroxyl-9-octadecenoic acid(化合物6)和methyl 12-hydroxyoctadecanoate(化合物7)。由图5可知,节点簇B中,节点543.1 291([M+H]+)的二级质谱与GNPS光谱库数据一致,故将其鉴定为rugulosin A(化合物8);根据节点559.124 2([M+H]+)和575.119 1([M+H]+)与543.129 1(rugulosin A,化合物8)的关系,将其分别鉴定为rugulosin B(化合物9)和rugulosin C(化合物10)。

由图6可知,节点315.050 3([M+H]+)和301.034 4([M+H]+)的二级质谱与GNPS光谱库数据一致,故将其分别鉴定为endocrocin(化合物11)和emodic acid(化合物12);根据297.0 397([M+H]+)和329.065 9([M+H]+)与315.050 3(endocrocin,化合物11)的关系,推测上述2个节点化合物分别为2,3-anthracenedicarboxylic acid(化合物13)和2-acetyl-1,3,8-trihydroxy-6-met hoxyanthracene-9,10-dione(化合物14); 依据节点301.034 4(emodic acid,化合物12),可推测317.029 2([M+H]+)和316.046 5([M+H]+)分别为2-(dihydroxymethyl)-1,6,8-trihy droxy-3-methylanthracene-9,10-dione(化合物15)和1,4,5-trihydroxy-8-[(3-hydroxyp ropyl)amino]anthracene-9,10-dione(化合物16);二级质谱显示,节点187.060 2[M+H]+(C8H10O5,tR=2.06 min)与节点173.044 5[M+H]+(C7H8O5,tR=1.51 min)的MS2碎片非常相似,节点187.060 2仅比节点 173.044 5 多1个信号(187.060 2[M+H]+),提示2个节点分子具有相同的骨架,但因没有更多的信息,暂未鉴定出它们的具体结构。此外,节点271.060 2与“种子”化合物1具有相同的二级质谱,是同一个化合物。

由图7可知,节点簇D中,节点211.144 3([M+H]+)的二级质谱与GNPS光谱库数据一致,故将其鉴定为cyclo(Pro-Leu)(化合物17),在此基础上,推测节点197.128 4([M+H]+)、213.160 0([M+H]+)和245.128 4([M+H]+)分别为cyclo(Pro-Val)(化合物18)、cyclo(Val-Ile)(化合物19)和cyclo(Phe-Pro)(化合物20)。节点簇E中,节点235.096 6([M+H]+)的二级质谱与GNPS光谱库数据一致,故将其鉴定为 7-hydroxy-3-(2-hydroxypropyl)-5-methyl-1H-isochromen-1-one(化合物21),并进一步将节点219.101 7([M+H]+)鉴定为5-hydroxy-7-methyl-4-propyl-2H-chromen-2-one(化合物22)。化合物5至化合物22的结构见图8。

3 讨论

海洋微生物是具有显著生物活性和药用前景先导化合物的潜在来源[13-14]。从地中海链霉菌(Streptomycesmediterranoi)中分离得到利福霉素类化合物,以利福霉素B为先导化合物,经结构修饰得到治疗肺结核的利福平[15]。炭疽菌引起的苹果炭疽叶枯病(Glomerellaleaf spot,GLS)是我国近年来新发现的一种危害严重的流行性病害和重点防治对象,珊瑚共生链霉菌(Streptomycessp.)DC4-5产生的新大环内酯化合物iseolides A～iseolides C对炭疽菌(Glomerellacingulate)具有较明显的抑制作用,最低抑菌浓度(MIC)为0.19～6.25 μg/mL;抑菌活性测定结果显示,它们对人的致病菌如白色念珠菌(Candidaalbicans)和红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)具有类似的抑制作用[16]。海藻内生真菌Acremoniumvitellinum产生的新天然产物——氯霉素衍生物(4S)-4-[(S)-hydroxy(4-nitrophenyl)methyl]-2-oxazolidinone对棉铃虫具有显著的杀虫活性,其LC50为(0.56±0.03)mg/mL,与阳性对照苦参碱[LC50为(0.24±0.01)mg/mL]相当[17]。海洋微生物是极具研究开发价值的生物活性次生代谢物的有效生产者,是一个潜力巨大的微生物新资源库[1]。

基于LC-MS/MS的GNPS分子网络是一种可应用于天然产物分析的可视化工具[18],其Library Search功能可快速、大规模地鉴定已知化合物和相似化合物,并挖掘新化合物;此外,GNPS分子网络在分析菌株代谢产物多样性方面具有强大的统计学优势,可用于指导菌株培养方法和提取工艺的优化[19]。本研究采用GNPS分子网络分析Talaromycessp.ML-3发酵液的化学成分,从其发酵液中共识别出22个化合物,具体为:11个蒽醌类化合物(3个二蒽醌和8个单蒽核蒽醌)、3个脂肪酸类化合物、4个环二肽、2个香豆素类化合物、1个吲哚生物碱和1个麦角甾醇,这些结构类型的化合物不乏极具潜力的先导化合物。

大黄素等4种天然蒽醌化合物与新白叶藤碱衍生物Z-24复配得到的农用杀菌剂能防治立枯丝核菌、禾谷镰刀菌和稻瘟病病菌等引起的植物病害,表现出杀菌谱较广、毒性较低、有效延缓植物病原菌耐药性产生等优势[20]。二蒽醌通常由2个相同或不同的蒽醌单体通过1～4个C—C键连接在一起,与单体相比,二聚化赋予其良好的生理活性。从PenicilliumislandicumSopp.中分离得到的二蒽醌skyrin对小鼠白血病细胞L1210具有细胞毒活性[21];从PenicilliumradicumFKI-3765-2中分离得到的二蒽醌rugulosins A～rugulosins C均可抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[22]。研究显示,Talaromycessp.YE3016中存在同时控制skyrin和rugulosin A生物合成的rug基因簇[23];Talaromyces属真菌中,T.rugulosus[24]、T.brunneus[25]和T.wortmannii[26]是skyrin和rugulosin A的共同生产者。本研究发现,Talaromycessp.ML-3发酵液中存在rugulosins A～rugulosins C(化合物8～化合物10),说明它也是二蒽醌的有效生产者。Talaromycessp.ML-3发酵产物化学成分十分丰富,但目前只识别出其中少量化合物,后续将进一步以已知化合物作为“种子”进行化学成分的识别,以期挖掘发现新的和/或具有活性的化合物。

4 结论

从牡蛎共生真菌Talaromycessp.ML-3发酵液粗浸膏中分离纯化得到4个化合物:emodin(化合物1)、3-indolethanol(化合物2)、ω-hydroxy-emodin(化合物3)和(22E,24R)-8,14-epoxyergosta-4,22-diene-3,6-dione(化合物4)。LC-MS/MS分子网络分析结果显示,Talaromycessp.ML-3发酵液中含有丰富的化学成分,包括蒽醌类、脂肪酸类、环二肽类、香豆素类、吲哚生物碱和麦角甾醇类等物质。本研究结果为后续化合物的导向分离和新活性化合物的挖掘提供了依据。