4种抑菌化合物影响杧果炭疽病菌漆酶的转录

谭晴 ，刘晓妹 ，张梦婷 ，董玲玲 ，肖春丽 ，蒲金基 ，张贺 *

（1.海南大学植物保护学院/热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南 海口 571101）

杧果炭疽病是杧果生长期和采后贮藏期危害最严重的病害之一，在世界杧果产区普遍发生［1］，主要由半知菌类刺盘孢属胶胞炭疽菌（Colletotri⁃chum gloeosporioides）所引起［2］，其寄主范围广，除杧果外，绝大部分亚热带、热带果树，多种蔬菜、水果、花卉、经济林木和中草药等都是其寄主。胶孢炭疽菌侵入寄主主要是通过其分生孢子萌发形成附着胞，黑化的附着胞会产生巨大的膨压使得侵入钉能够侵入寄主内，从而在寄主内扩展蔓延，最终导致寄主发病［3］。杧果炭疽病的防治目前主要依靠化学农药，但其已对多菌灵、甲基硫菌灵、苯菌灵、噻菌灵产生了抗药性［4-5］，对咪鲜胺也已表现出潜在的抗性风险［5-6］。对苯醚甲环唑也产生了耐药性［2］。可见探明杧果炭疽病致病机理和寻找新的防治靶标显得尤为重要，如茶多酚、白藜芦醇和丁香酚对胶孢炭疽菌的菌丝生长有较好的抑制作用［7-10］。

漆酶（Laccases，p-benzenediol： dioxygenoxido⁃reductases，EC 1.10.3.2，lac），是一种含有金属铜离子的多酚氧化酶［11-12］，能催化各种芳香基化合物的单电子氧化，同时伴随着氧气还原为水［13］。漆酶以非等位多基因家族的形式存在于基因组中，编码具有不同作用的多酚氧化酶同工酶。在同种病原菌中，不同漆酶基因家族成员的功能也存在一定的差异，并不是所有的漆酶基因在植物病原菌中都发挥与致病相关的作用［14］。漆酶可作为潜在的抑菌化合物靶标，致病真菌马尔尼菲篮状菌（Talaromy⁃ces marneffei）漆酶基因和致病真菌新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）漆酶基因lac1被敲除后都对抑菌化合物敏感性增加，所以漆酶被认为是潜在的抑菌化合物靶标［15-17］，不同漆酶基因的转录调控不尽相同。漆酶基因家族成员在同一物种中具有不同的表达水平，糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）的12个漆酶中lacc2和lacc10是漆酶活性的主要来源［18］。漆酶基因的表达具有明显的组织差异性，香菇10个漆酶基因在不同的发育阶段的转录表达存在明显差异［19］。漆酶家族基因的表达受到营养条件及外源性物质的诱导。

作者前期在杧果炭疽病菌中发现了13个漆酶基因［20］，本研究通过开展测定4种抑菌化合物对杧果炭疽病菌菌丝生长、分生孢子萌发、附着胞形成及对黑色素合成的影响，同时测定这4种抑菌化合物对杧果炭疽病菌漆酶家族13个成员的表达影响及对漆酶酶活的影响，旨在为寻求杧果炭疽病菌抑菌化合物提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

杧果炭疽病菌（C.gloeosporioides）A2菌株，由实验室提供，试管斜面保存。

1.1.2 供试试剂

98%白藜芦醇和98.5%丁香酚购自上海源叶生物科技有限公司，98%茶多酚和98%氟康唑购自北京索莱宝科技有限公司，99.9%二甲基亚砜（DMSO）为国产分析纯。漆酶酶活性试剂盒来源于苏州科铭生物技术有限公司。SuperReal Pre⁃Mix Plus （SYBR Green）、FastKing RTKit来源于Tiangen。植物RNA提取试剂盒、cDNA第一链反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均来源于TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 4种抑菌化合物对病菌菌丝生长的影响

采用菌丝生长速率法测定。将新鲜菌饼接入终浓度为 10 000、5000、2500、1250、625、0 mg·L-1茶多酚，终浓度为6055、3027、1514、757、378、0 mg·L-1白藜芦醇，终浓度为 657、328、164、82、41、0 mg·L-1的 丁 香 酚 及 终 浓 度 为 3063、1531、766、383、191、0 mg·L-1的氟康唑的PDA平板上，以不含药剂的PDA平板作对照。对溶于水的抑菌化合物以灭菌无菌水进行配置，对照为等量无菌水，对不溶于水的其余抑菌化合物用二甲基亚砜溶解，相应对照用等量二甲基亚砜代替，每处理重复3次。28 ℃培养4 d后，用十字交叉法测量菌落直径。用Excel作图分析，以浓度对数值（x）为横坐标，抑菌率的机率值（y）为纵坐标进行作图，求得各抑菌化合物对杧果胶孢炭菌病菌的毒力回归方程、EC50和R2［21］，确定 4种抑菌化合物对供试菌株生长的影响。

1.2.2 4种抑菌化合物对杧果炭疽病菌分生孢子萌发和附着胞形成的影响

参照董玲玲等［20］的方法，配置各抑菌化合物母液，用终浓度为 100 mg·L-1的茶多酚、168 mg·L-1的白藜芦醇、164 mg·L-1丁香酚和 306 mg·L-1氟康唑处理分生孢子并使分生孢子终浓度为5×105个·L-1进行混匀。以分生孢子芽管长度超过分生孢子直径的1/2为萌发标准，附着胞完全黑化为附着胞形成标准［22］，6 h开始测定各处理对分生孢子萌发的影响，12 h开始测定各处理对附着胞形成的影响。

1.2.3 4种抑菌化合物对病菌黑色素形成的影响

根据各抑菌化合物对菌丝生长的EC50测定各处理对供试菌株黑色素合成的影响。将供试菌株分别接种在终浓度为 15 010、1 109.88、308.26、163.52 mg·L-1的茶多酚、白藜芦醇、丁香酚和氟康唑 PDA 平板上，28 ℃培养 10 d，参照 Wei等［23］的方法，提取各处理等质量菌丝体的胞内黑色素。

1.2.4 抑菌化合物对病菌漆酶基因家族成员相对表达量的影响

参考董玲玲等［20］的方法，取1 mL分生孢子悬浮液加入终浓度为100 mg·L-1的茶多酚，168 mg·L-1的白藜芦醇、164 mg·L-1的丁香酚和 306 mg·L-1的氟康唑的PD培养基中，28 ℃，180 r·min-1摇培1 d后取菌丝提取总RNA并反转录成cDNA，参考肖春丽等［24］委托北京六合华大基因公司合成表1引物并进行实时荧光定量PCR分析。内参基因为18S rRNA［24］。

表1 用于炭疽病菌漆酶基因家族成员的定量引物［24］Table 1 Primers for quantification of laccase gene family members of Colletotrichum gloeosporioides

1.2.5 抑菌化合物对病菌胞外漆酶活性的作用

参照董玲玲等［20］的方法，第10天是胞外酶活产漆酶高峰期，因此将第10 d的培养液12 000xg离心10 min，离心后弃沉淀，所得上清即为胞外粗漆酶。后续按照漆酶酶活试剂盒进行测定。

2 结果与分析

2.1 4种外源抑菌化合物对病菌菌丝生长的影响

试验结果表明，杧果炭疽病菌在不同抑菌化合物不同浓度处理下，4种抑菌化合物对菌丝的生长都起到显著的抑制作用，随着浓度升高，抑制菌丝生长越显著（图1）。根据表2，4种抑菌化合物的EC50值中茶多酚最大，其次为白藜芦醇、丁香酚和氟康唑，其 EC50值依次为 15 010、1 109.88、308.26、163.52 mg·L-1。根据回归方程中斜率分析来看，杧果炭疽病菌对丁香酚最敏感，其次分别为白藜芦醇、茶多酚，最后为氟康唑。综合上述，3种酚类抑菌化合物的抑菌效果显著且敏感，而咪唑类化合物氟康唑EC50值虽较低，但病原菌对其敏感度较低。

图1 4种抑菌化合物对菌丝生长的影响Fig.1 Effects of four antibacterial compounds on mycelium growth

表2 4种抑菌化合物对杧果炭疽病菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of four antibacterial compounds on Colletotrichum gloeosporioides

2.2 4种外源抑菌化合物对病菌黑色素含量的影响

与对照组相比，茶多酚和白藜芦醇的胞内黑色素含量均显著下降7%（图2）。而丁香酚和氟康唑的胞内黑色素含量均较对照显著增加，其中丁香酚增加了3.3%，而氟康唑增加了18.5%。表明这4种抑菌化合物对杧果炭疽病菌黑色素合成的影响程度差异显著。

图2 4种抑菌化合物对黑色素含量的影响Fig.2 Effect of four antibacterial compounds on melanin content

2.3 4种抑菌化合物对分生孢子萌发和附着胞形成的影响

通过观察分生孢子萌发率发现（图3），茶多酚、白藜芦醇、丁香酚和氟康唑都较对照组显著促进分生孢子萌发。相比于对照，茶多酚促进了28.3%的孢子萌发，白藜芦醇促进了12.0%的孢子萌发，丁香酚促进了26.0%的孢子萌发，氟康唑促进了18.6%的孢子萌发。相反，在附着胞形成方面，这4种化合物都出现了显著的抑制作用。相比于对照组，茶多酚抑制了50.3%的附着胞形成，白藜芦醇抑制了28.4%附着胞形成，丁香酚抑制了54.9%附着胞形成，氟康唑抑制了38.0%附着胞形成。表明这4种抑菌化合物都能对分生孢子萌发起促进作用，但对附着胞的形成有抑制作用。

图3 4种抑菌化合物对分生孢子萌发和附着胞形成的影响Fig.3 Effects of four antibacterial compounds on conidial germina⁃tion and appressorium formation

2.4 4种抑菌化合物对病菌漆酶家族成员表达的影响

通过qRT-PCR分析发现（图4），与对照组相比，茶多酚和白藜芦醇都对约15%的家族成员的转录活性有抑制作用，丁香酚和氟康唑都对约23%的家族成员的转录活性有抑制作用。茶多酚对Cglac6、Cglac11的相对表达量起抑制作用，相比于对照，Cglac6的相对表达量下调62.6%，Cglac11的相对表达量下调了49.0%。白藜芦醇对Cglac11、Cglac13的相对表达量起抑制作用，相比于对照，Cglac11的相对表达量下调82.3%，Cglac13的相对表达量下调了76.8%。丁香酚对Cglac4、Cglac5、Cglac13的相对表达量起抑制作用，相比于对照，Cglac4的相对表达量下调94.2%，Cglac5的相对表达量下调了94.9%，Cglac13的相对表达量下调99.9%。氟康唑对Cglac4、Cglac9、Cglac13的相对表达量起抑制作用，相比于对照，Cglac4的相对表达量下调71.2%，Cglac9的相对表达量下调了65.7%，Cglac13的相对表达量下调99.9%。总之，各处理对杧果炭疽病菌漆酶家族成员各基因的转录调控有所差异。

图4 4种抑菌化合物对杧果炭疽病菌漆酶家族成员表达的影响Fig.4 Effects of four antibacterial compounds on the expression of laccase family members of Colletotrichum gloeosporioides

2.5 4种抑菌化合物对病菌相对胞外漆酶酶活的作用

结果表明（图5），杧果炭疽病菌胞外漆酶酶活受茶多酚、白藜芦醇、丁香酚和氟康唑影响显著，与对照组相比茶多酚抑制了96%的酶活，白藜芦醇抑制了67%的酶活，丁香酚抑制了84%的酶活，氟康唑抑制了17%的酶活；茶多酚、白藜芦醇和丁香酚对漆酶的抑制效果均高于氟康唑。

图5 4种抑菌化合物对杧果炭疽病菌相对胞外漆酶酶活的作用Fig.5 Effects of four antibacterial compounds on the activity of ex⁃tracellular laccase of anthrax bacteria from Colletotrichum gloeosporioides

3 讨论

茶多酚对多种刺盘孢属病原菌的抑制中浓度均在3000~50 000 mg·L-1之间，其中对茶炭疽病菌的抑制效果最好，对梨炭疽病菌的抑制效果相对较差［7］；茶多酚抑制八角炭疽病菌的EC50值为12 840 mg·L-1［8］。而本文中茶多酚对杧果炭疽病菌的 EC50为15 010 mg·L-1，低于多个刺盘孢属成员，高于八角炭疽病菌。茶多酚浓度为10 000 mg·L-1时，对香蕉炭疽病菌分生孢子萌发抑制率为20.50%，对菌丝生长抑制率为 23.33%［25］；浓度为 2000 mg·L-1和3330 mg·L-1的茶多酚处理稻瘟菌的分生孢子，分生孢子虽能萌发，但芽管的伸长受到限制从而起到抑菌作用，而浓度 5000 mg·L-1和 10 000 mg·L-1的茶多酚处理稻瘟菌分生孢子，分生孢子不能萌发、会破裂，且菌丝生长抑制率达100%，起到杀菌作用［26］；而本试验中使用 100 mg·L-1的茶多酚浓度处理分生孢子，虽起到了促进分生孢子萌发的现象，但抑制附着胞的形成。白藜芦醇对草莓胶孢炭疽菌的 EC50值 为 3200 mg·L-1［9］，10 mg·L-1和 50 mg·L-1的白藜芦醇能显著抑制灰葡萄孢菌的分生孢子萌发，200 mg·L-1的白藜芦醇对4株灰葡萄孢菌菌丝生长抑制率为18.4%~38.1%［27］，而本文中测定的168 mg·L-1的白藜芦醇促进了12.0%的分生孢子萌发、抑制附着胞的形成，菌丝生长抑制率为50%时，白藜芦醇浓度为1 109.88 mg·L-1。何庭玉等［10］表明丁香油中的丁香酚对杧果炭疽病菌有抑菌效果且与丁香酚含量成正比，与本文研究的结果一致，且本试验所测得的 EC50为 308.26 mg·L-1。王江来等［28］表明，丁香酚对腐皮镰刀菌的菌丝生长和分生孢子萌发均有抑制作用，而本实验测试结果中，丁香酚对杧果炭疽病菌分生孢子萌发有促进作用，对菌丝生长有抑制作用，表明，同种化合物对不同病原菌的分生孢子萌发和菌丝生长存在差异。

在漆酶家族基因表达分析中茶多酚和白藜芦醇均对15%家族成员的转录活性有抑制作用，丁香酚和氟康唑分别抑制30%和23%家族成员的转录调控，且都对漆酶基因CgLac4的转录调控有显著抑制作用。在作者前期研究［20］，已测定Fe2+等不同离子和肉桂酸等有机物对杧果炭疽病菌漆酶家族成员表达的影响，其中Fe2+等13种离子以及半胱氨酸、对甲氧基苯胺、对羟基苯甲酸、肉桂酸和香草酸等都对杧果炭疽病菌胞外漆酶活性起抑制作用。本试验中的茶多酚、白藜芦醇、丁香酚和氟康唑所测定的浓度中均起抑制作用。白藜芦醇在玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）中会抑制漆酶基因Stlac1的表达［25］，茶多酚、丁香酚和氟康唑对杧果炭疽病菌的调控作用属于本文首次报道。这说明通过添加外源的离子、酚类可以起到抑制病原菌漆酶活性的作用，具有一定的田间应用潜力，可以与化学药剂共同施用，增加病害的防治效果。

病原菌附着胞侵入寄主需要黑色素产生巨大的膨压才能进行，DHN黑色素前体分子需要漆酶参与将其转变为DHN自由基，再经分子间交联聚合形成DHN黑色素［26］。这4种化合物都显著抑制漆酶酶活，并且茶多酚和白藜芦醇都显著抑制了菌丝中黑色素含量，与试验结果一致。然而，丁香酚和氟康唑虽对漆酶酶活有抑制，反而却促进了黑色素合成，丁香酚和氟康唑的EC50值都小于茶多酚和白藜芦醇，表明同样抑菌效果下，所需丁香酚和氟康唑的浓度都低于茶多酚和白藜芦醇的浓度。虽然丁香酚和氟康唑虽促进黑色素形成，但在菌丝生长方面却有好的抑制作用，而白藜芦醇虽抑制酶活和黑色素含量，但其抑菌效果没有丁香酚和氟康唑好，在灰葡萄孢侵染过程中，其漆酶可以将植物分泌的植保素白藜芦醇氧化成维尼非林（viniferin）［27］，且致病性强弱与病菌的漆酶酶活有关。由于漆酶底物广泛性和同工酶复杂性，其底物多为次级代谢产物，具有数量多、含量少、鉴定困难等特点，从而导致对漆酶生物功能的解析多停留在表型分析，也导致研究困难［28］。

4 结论

本文测试了4种外源抑菌化合物对杧果炭疽病菌的菌丝生长，分生孢子萌发与附着胞形成、黑色素含量、对家族成员转录的影响以及对漆酶酶活的影响。在菌丝生长中，丁香酚的有效中浓度较低且病原菌对其最敏感，氟康唑的有效中浓度最低，这2个抑菌化合物都抑制附着胞的形成和胞外酶活性，同时也对漆酶基因Cglac4的转录调控有显著抑制作用。后续将进一步研究这2个抑菌化合物与漆酶基因Cglac4的关系，为寻找杧果胶孢炭疽病菌漆酶基因Cglac4的抑菌化合物提供参考。