黄连素通过TLR4途径对大鼠脊髓损伤后神经功能的影响及相关机制研究
2023-05-05李艳兵
李艳兵
(恩施土家族苗族自治州中心医院脊柱外科,湖北恩施 445000)
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)会导致神经元功能障碍,严重损害了人类健康[1]。有研究指出,炎症反应导致的细胞凋亡在SCI继发性损伤的病理过程中起关键作用,针对性减少的继发性炎症反应可有效促进SCI后的神经元恢复[2]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)相关通路会在SCI继发性损伤过程中激活,并诱导炎性反应[3]。黄连素是一种异喹啉类生物碱,具有多种生化功能,包括调节抗炎作用、淋巴细胞免疫调节等,最新的研究显示,黄连素可以通过抑制线粒体损伤以缓解大鼠的SCI损伤,但是其机制尚不清楚[4]。有研究发现,黄连素可以通过抑制TLR4信号通路调节肠道菌群并降低胰岛素抵抗[5]。鉴于此,本文主要分析黄连素通过TLR4途径对大鼠SCI后神经功能的影响及相关机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料和器材
健康SD大鼠(清洁级,雄性,260～300 g,南京医科大学动物实验中心)。黄连素(Sigma公司,美国)。ELISA试剂盒(碧云天公司)。Trizol试剂(Invitrogen公司,美国)。逆转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR试剂盒(Roche公司,瑞士)。RIPA裂解缓冲液(中国,北京,Beyotime)。BCA蛋白测定试剂盒(北京Applygen公司,中国)。anti-Bcl2、anti-caspase3、anti-Bax、anti-TLR4、anti-MyD88和二抗(Abcam公司,美国)。ECL试剂盒(Amersham,美国)。
1.2 大鼠分组、建模和干预方法
将36只大鼠随机分为3组各12只:对照组、SCI组和SCI+黄连素组。SCI组和SCI+黄连素组根据参考文献[6]建立SCI模型,具体方法如下:①通过腹膜内注射2%的戊巴比妥钠麻醉大鼠,然后将大鼠俯卧固定置于立体定向框架中。在脊柱正上方作切口,并进行椎板切除术以暴露大鼠的T10胸椎。然后将重量为10 g的撞击器从20 mm高处垂直掉落到裸露的脊椎上建立SCI,缝合伤口。然后进行常规抗感染处理,每天注射80000U的青霉素,连续7 d。每天至少按摩2次以促进排泄。②对照组仅进行暴露脊椎和缝合。③SCI+黄连素组在建模后,使用黄连素灌胃[4],剂量为5 mg/100 g,每日1次,干预7 d。对照组和SCI组大鼠使用等量的生理盐水灌胃。
1.3 检测指标和方法
1.3.1 运动功能评价
通过Basso, Beattie and Bresnahan(BBB)运动功能评分法[7]评估运动功能,评估项目包括肢体功能、协调程度、踩踏能力和躯干稳定性。BBB评分范围为0(表明没有可观察到的后肢运动)～21分(表明在正常的后肢运动)。分别在建模前、建模后1 d和7 d进行评估。
1.3.2 ELISA检测血清炎性因子水平
通过剪尾收集大鼠外周血液样本,离心收集上层血清,根据说明书加入抗体和显色剂,利用酶标仪检测450 nm下的吸光度,通过标准曲线计算TLR4通路相关炎性因子的浓度,包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)。
1.3.3 Westernblot
将脊髓组织裂解、萃取总蛋白,BCA法计算浓度,将40 μg的总蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(PAGE)(80～120 V,90 min)分离。在100 mV的恒定电压下,与PVDF膜进行湿转移。在5%牛血清白蛋白中于室温孵育1 h。将1:500稀释的anti-Bcl2、anti-caspase3、anti-Bax、anti-TLR4和anti-MyD88添加到PVDF膜中,并在4°C下孵育过夜。洗涤后,在室温下添加二抗孵育1 h,然后加入ECL试剂盒进行显影。GAPDH作为内参,用Image J软件分析目标条带的灰度值,计算蛋白相对表达水平。
1.4 统计学处理
2 结果
建模前,各组大鼠BBB评分均为21分,提示运动功能正常;建模后1 d,SCI组和SCI+黄连素组的BBB评分显著降低(P<0.05),提示建模成功。
建模后7 d,各指标如下:SCI组的BBB评分 表1 黄连素对SCI大鼠模型BBB评分的影响 表2 黄连素对SCI大鼠模型血清TNF-α和IL-6的影响 表3 黄连素对SCI大鼠模型脊髓组织中凋亡蛋白Bax、caspase3、Bcl2水平的影响 表4 黄连素对SCI大鼠模型脊髓组织中TLR4、MyD88水平的影响 图1 Western blot检测黄连素对SCI大鼠模型脊髓组织中凋亡蛋白Bax、caspase3、Bcl2水平的影响 图2 Western blot检测黄连素对SCI大鼠模型脊髓组织中TLR4通路的影响 SCI继发性损伤是在原发性损伤之后,由于氧化应激、炎性反应、免疫功能障碍和神经元凋亡等引起的损伤,在此过程中,神经元的损伤是可逆的[8]。目前尚无治疗SCI的特效方法,中药因具有较好的疗效和较低的不良反应,在SCI的治疗中获得了关注。 黄连素是中草药黄连的主要活性单体,其分子式是C20H19NO5,分子量为353.36,研究显示,黄连素具有神经保护、抗炎和抗氧化作用,动物实验结果显示,黄连素可以促进大鼠脊髓根部撕脱再植入后运动神经元的存活和轴突再生[9]。岳旭珂等[10]研究显示,黄连素可以抑制SCI损伤后的细胞凋亡。本次研究显示,黄连素可以显著提高SCI大鼠模型的BBB评分,改善神经功能,并减少凋亡蛋白caspase3和Bax的表达,诱导抗凋亡蛋白Bcl2的上调。鲍和等[11]的研究显示,黄连素可以保护β-淀粉样蛋白以减轻神经元损伤。也有研究显示,黄连素可以通过抑制心肌细胞凋亡缓解缺氧/复氧对心肌的损伤[12]。这提示在SCI模型中,黄连素可以通过抑制脊髓中神经元的凋亡缓解神经功能损伤。 为进一步分析黄连素抑制SCI大鼠模型脊髓中细胞凋亡的机制,本研究检测了TLR4通路及其相关炎性因子的水平。TLR4通路是非特异性免疫的重要通路,与损伤密切相关,机体在受到氧化应激、脂多糖、炎性反应的作用下,TLR4相关通路被激活,并且会通过下游信号的转导,诱导促炎因子的大量表达并诱导细胞凋亡。有研究已经显示,TLR4相关通路在SCI后的继发性损伤过程中被激活,进而引起下游炎性因子TNF-α和IL-6的水平升高,使脊髓神经元发生炎性损伤和凋亡[13]。本研究结果显示SCI组的TNF-α、IL-6和TLR4水平显著高于对照组,SCI+黄连素组的TNF-α、IL-6和TLR4水平显著低于SCI组。有研究显示,通过微小RNA-27a抑制TLR4通路可以使TNF-α等炎性细胞因子的水平明显降低,从而缓解SCI损伤[14]。Zhang等[15]的研究也显示,抑制TLR4通路对于改善炎性反应、缓解神经元凋亡,具有重要的作用。此外,黄连素可以通过抗炎作用保护颅脑外伤的小鼠的继发性损伤,并保护小鼠的神经功能[16]。Wang等[17]的研究显示,黄连素可以通过抑制促炎因子的表达,并触发少突胶质细胞自噬,保护神经元免受损害。这提示在SCI中,TLR4引起的炎性反应和神经元损伤是诱导神经元凋亡的重要因素,而黄连素可能通过抑制TLR4通路和炎性反应,减少SCI大鼠模型神经元凋亡,从而保护SCI后的神经损伤。 综上所述,黄连素可以通过抑制TLR4通路和炎性因子的水平抑制脊髓中神经元凋亡,从而保护SCI大鼠模型的神经功能。关于黄连素调节TLR4通路和炎性因子的机制,值得深入研究。
3 讨论
