一株耐盐Cr(Ⅵ)还原菌的分离鉴定和还原特性研究

杨晓宇 靳宝林 王熙宁 白林含

为解决高无机盐废水中的铬（Chromium，Cr）的六价铬Cr（Ⅵ）污染问题，从高盐环境中分离得到一株Cr（Ⅵ）还原菌，命名为KL01，经分子鉴定为墓画大洋芽孢杆菌（Oceanobacillus picturae），通过对KL01的生理特征分析发现其为一株中度嗜盐菌.以SEM、TEM结合能谱对Cr（Ⅵ）胁迫下的菌体进行了检测，发现KL01对Cr仅有少量的胞内吸附，无胞外吸附，且高浓度的Cr（Ⅵ）可使菌体长度增加.通过KL01在不同环境条件还原Cr（Ⅵ）能力的影响研究，发现其在有氧条件下，30 ℃，pH 7.5，NaCl浓度6%时，具有较好的还原Cr（Ⅵ）的效果；当Cr（Ⅵ）浓度为20 mg/L时，对其的还原率可达96%以上.这表明KL01对高盐环境中的Cr（Ⅵ）具有良好的去除效果，可用于处理高盐含Cr（Ⅵ）废水.

铬污染； 高盐环境； 墓画大洋芽孢杆菌； 生物还原

Q93A2023.016004

收稿日期： 2022-05-05

基金项目： 成都市科技项目（2021-YF05-01171-SN）; 国家重点研发计划（2018YFC1802605）

作者简介： 杨晓宇（1997-）， 女， 四川绵阳人， 硕士研究生， 研究方向为资源微生物. E-mail： 2019222040084@stu.scu.edu.cn

通讯作者： 白林含. E-mail： bailinhan@scu.edu.cn

Isolation， identification and reduction characteristics of a salt-tolerant Cr（Ⅵ） reducing strain

YANG Xiao-Yu， JIN Bao-Lin， WANG Xi-Ning， BAI Lin-Han

（Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Education， College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064， China）

In order to solve the problem of hexavalent chromium Cr（Ⅵ） pollution in high inorganic salt wastewater， a strain of Cr（Ⅵ） reducing bacteria， named KL01， was isolated from the hypersaline environment and molecularly identified as Oceanobacillus picturae. The physiological characteristics of KL01 revealed that it is a moderately halophilic strain. The cells under Cr（Ⅵ） stress were examined by SEM and TEM combined with EDS， and it was found that KL01 showed only a small amount of intracellular adsorption of chromium， but no extracellular adsorption and the high concentration of Cr（Ⅵ） caused an increase in the length of the bacteria. Single-factor experiments were conducted to investigate the ability of different environmental conditions on the reduction of Cr（Ⅵ） by KL01. It was found that KL01 had a better Cr（Ⅵ） reduction effect under aerobic conditions， 30 ℃， pH 7.5 and 6% NaCl concentration， and the reduction rate for 20 mg/L Cr（Ⅵ） was above 96%. It was shown that KL01 has a good removal effect on Cr（Ⅵ） in hypersaline environment and can be used for the treatment of Cr（Ⅵ） in the hypersaline wastewater.

Chromium contamination; Hypersaline environment; Oceanobacillus picturae; Bioreduction

1 引 言

自工业化以来，重金属的污染一直持续影响着水体与土地，其中包括《污水综合排放标准》［1］中规定的第一类污染物——铬.铬常被用于工业生产中，如电镀厂［2］，化工厂［3］和采矿厂［4］等，不当的排放则会导致铬污染.自然界中，铬离子的主要存在形式为六价铬（Cr（Ⅵ））和三价铬（Cr（Ⅲ））.Cr（Ⅲ）作为一种哺乳动物代谢所需的微量元素，具有一定毒性，但低浓度时不呈现，毒性仅为Cr（Ⅵ）的百分之一［5］.且Cr（Ⅲ）化合物可被土壤吸附，形成溶解度极低的沉淀.相反，Cr（Ⅵ）因其极强的水溶性随废水排放或经土壤渗透进入地表水，影响到河流及沿岸的生态，甚至通过食物链进入人体.Cr（Ⅵ）可破坏生物体的生化代谢，引起氧化和非氧化形式的DNA损伤［5］，引起突变.对人体还可诱发皮肤溃疡、肾衰竭甚至癌症等.工业上处理含Cr（Ⅵ）废水常用的物理及化学方法如吸附法［8］、絮凝沉淀法［9］和电化学法［10］等，具有运行成本高、再生工艺复杂及二次污染等不足.

使用微生物来去除Cr（Ⅵ）为含Cr（Ⅵ）废水的处理提供了一种低成本且环境友好的方法.但由于许多工业废水中含盐量较高，大部分除Cr（Ⅵ）菌在高盐环境下能力受限［11， 12］，包括近年来分离出的多株能够除Cr（Ⅵ）的细菌，如希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）［13］、铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）［14］和无色杆菌（Achromobacter）［15］等，均不能耐受高盐浓度，在处理时必须增加除盐工序，提高成本.因此，挖掘更多能在高盐环境中除Cr（Ⅵ）的细菌具有重要的意义.

本研究从高无机盐环境中分离得到一株Cr（Ⅵ）还原菌KL01，对其进行了分子生物学鉴定，研究了该菌对Cr（Ⅵ）的耐受及还原特性，为微生物治理无机高盐含Cr（Ⅵ）废水提供了理论依据及实体资源.

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株来源 实验室保存的一株耐盐菌KL01.

2.1.2 培养基 使用6% NaCl LB培养基，成分为蛋白胨10 g，酵母浸提粉5 g，NaCl 60 g，蒸馏水定容至1000 mL.调pH至7.0，固体培养基含1.5%琼脂.121 ℃高压蒸汽灭菌20 min.NaCl量及pH需根据实验所需盐浓度和pH微调.

2.2 实验方法

2.2.1 菌落形态观察 接种KL01菌株至含盐的固体LB培养基30 ℃培养2 d后，观察并记录菌落形态.

2.2.2 扫描电镜（SEM）观察 将KL01在含盐液体LB培养基中培养后，离心，取沉淀进行洗涤，经戊二醛固定、磷酸缓冲液漂洗、乙醇梯度脱水、临界点干燥及喷镀后，上机观察.

2.2.3 透射电镜（TEM）观察 将KL01在含盐液体LB培养基中培养后，离心，取沉淀使用戊二醛固定、丙酮逐级脱水、Epon812环氧树脂渗透、包埋、超薄切片及醋酸铀和枸橼酸铅染色后，上机观察.

2.2.4 16S rDNA鉴定 接种KL01菌株至含盐LB液体培养基中培养，以煮沸法提取DNA，使用16S rDNA通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR扩增该菌株的16S rDNA序列.将扩增产物送至擎科生物科技有限公司测序，并将结果在NCBI进行上blast比对，使用邻接法构建系统发育树.

2.2.5 KL01的最适生长条件和生长曲线 按1∶100接种KL01菌株至梯度pH、梯度盐浓度的LB培养基中，在不同温度条件下震荡培养2 d，平行3个样本.每12 h取样一次，使用酶标仪测定OD600 nm.按KL01的最适生长条件对其进行培养，每2 h取样使用酶标仪测定OD600 nm，绘制KL01的生长曲线.

2.2.6 KL01的耐盐能力 按1∶100接种KL01菌株至NaCl浓度梯度的LB培养基中，在最适生长温度下培养48 h，使用分光光度计测定OD600 nm值，检测菌株是否生长.

2.2.7 KL01的耐Cr（Ⅵ）能力 Cr（Ⅵ）以K2Cr2O7的形式提前配制成1 g/L Cr（Ⅵ）标准贮藏液，使用时稀释至10 mg/L.按1∶100接种KL01菌株培养基中，再加入Cr（Ⅵ）至梯度终浓度，于2.2.5所得的最适生长条件下培养24 h，使用分光光度计测定OD600 nm值，检测Cr（Ⅵ）对KL01的最小抑制浓度（MIC）.

2.2.8 Cr（Ⅵ）胁迫后KL01的SEM -EDS检测 将KL01在含不同浓度的Cr（Ⅵ）培养基中在最适生长条件培养48 h后，制样方法同2.2.2，上机进行扫描电镜-X射线能谱（SEM-EDS）检测.

2.2.9 Cr（Ⅵ）胁迫后KL01的TEM-EDS Mapping检测 将KL01在含175 mg/L Cr（Ⅵ）培养基中在最适生长条件培养48 h后，制样方法同2.2.3，上机进行TEM-EDS Mapping检测.

2.2.10 KL01的驯化培养 将KL01菌株接种入初始浓度为100 mg/L Cr（Ⅵ）的含盐培养基中，每日加入Cr（Ⅵ）标液及新鲜培养基，逐步浓度增加至350 mg/L，驯化培养15 d.

2.2.11 KL01的除Cr（Ⅵ）能力 按1∶100接种KL01菌株培养基中，再加入Cr（Ⅵ）至终浓度为20、40、60、80和100 mg/L，于最适生长条件下培养48 h，体系中Cr（Ⅵ）的浓度按国标GB/T 7467-1987［16］中的二苯碳酰二肼法测定，计算Cr（Ⅵ）去除率.Cr（Ⅵ）去除率=（Cr（Ⅵ）初始浓度-测得的剩余Cr（Ⅵ）浓度）/ Cr（Ⅵ）初始浓度 × 100%.

2.2.12 温度对KL01去除Cr（Ⅵ）的影响 将KL01按1∶100接种入含20 mg/L Cr（Ⅵ）的最适生长条件下的培养基中，每个梯度设置3个重复，于25、30和35 ℃的温度下培养48 h，测定体系中Cr（Ⅵ）浓度，计算去除率.

2.2.13 pH对KL01去除Cr（Ⅵ）的影响 将KL01按1∶100接种入含20 mg/L Cr（Ⅵ）的，pH为6.5～9.0培养基中，每个梯度设置3个重复，于最适生长条件下培养48 h，测定体系中Cr（Ⅵ）浓度，计算去除率.

2.2.14 盐浓度对KL01去除Cr（Ⅵ）的影响 将KL01按1∶100接种入含20 mg/L Cr（Ⅵ）的，盐浓度为4%～14%培养基中，每个梯度设置3个重复，于最适生长条件下培养48 h，测定体系中Cr（Ⅵ）浓度，计算去除率.

3 结果与分析

3.1 形态特征

KL01菌落（图1a）在固体培养基上呈奶白色，圆形，直径约2 μm，边缘波纹状不整齐.由SEM观察到，菌体平均长度约为2.4 μm，表面光滑，呈杆状（图1b）.由TEM观察到菌体质壁清晰分明，胞质较均匀（图1c）.

3.2 分子鉴定结果

KL01的16S rDNA序列经NCBI网站BLAST工具比对后，使用ClustalW进行多序列比对，采用邻接法（Neighbor-Joining法）构建系统发育树（图2）.可见KL01与Oceanobacillus picturae SQA-14（序列登录号：MT110647.1）在同一分支中，相似性为99.93%，鉴定为墓画大洋芽孢杆菌（Oceanobacillus picturae）.其所属的大洋杆菌属（Oceanobacillus）曾被发现存在于韩国传统发酵食品辣酱中，芽孢杆菌可能产生抗生素抑制酵母菌的生长，控制发酵的产气量［17］.

3.3 KL01的最适生长条件及生长曲线

KL01在不同温度、pH及盐浓度下的生长情况如图3a～3c所示.KL01在35 ℃和37 ℃下初始生长速度较快，但会快速进入衰退期.而在25 ℃下KL01虽能保持较长的生长期，但生长速度缓慢，故KL01的最适生长温度为30 ℃.KL01在pH为7.0时的生长状态最好，但在6.5 ～ 9.0的环境中都能生存.KL01在盐浓度过高（8%）或过低（0%～3%）时生长菌受到一定的抑制，而在4%～7%的盐浓度下的生长情况差异不大，在6%盐浓度时的生长状态最好，属于中度嗜盐菌.综上，KL01的最适生长条件为30 ℃，pH 7.0，盐浓度6%.

将KL01在最适生长条件下培养后，测定OD600 nm值并绘制了KL01的生长曲线，见图3 d.KL01菌株生长的前8 h为延迟期，8 h时进入对数生长期，14 h时为菌株生长最活跃的时期，至20 h时进入稳定期.

3.4 KL01的抗逆性分析

3.4.1 KL01的耐盐性 在高盐浓度下，KL01的生长情况如图4a所示.KL01在6%～16%的盐浓度下可以生长，但在14%盐浓度下的生长已受到强烈抑制，在18%盐浓度下则完全被抑制.

3.4.2 KL01的耐Cr（Ⅵ）能力 KL01在不同浓度的Cr（Ⅵ）下的生长情况如图4b所示，随Cr（Ⅵ）浓度增加，OD600 nm值逐渐降低，表明Cr（Ⅵ）抑制了细菌的生长.KL01在200 mg/L Cr（Ⅵ）浓度下OD600 nm为0.37，仍可生长，但在225 mg/L Cr（Ⅵ）下培养后OD600 nm为0.15（<0.2），说明已严重抑制了细菌的生长，继续提升浓度至250 mg/L后，KL01的生长几乎完全被抑制，即Cr（Ⅵ）对中度嗜盐菌KL01的MIC为225 mg/L.

3.5 Cr（Ⅵ）胁迫后KL01的SEM-EDS检测

受Cr（Ⅵ）胁迫后的KL01菌体的SEM显微图见图5，在扫描电镜观察区域中随机选择3个区域，每个区域随机选择5个统计菌体长度.发现在100 mg/L Cr（Ⅵ）下，少部分菌体长度达到5 μm；在125 mg/L Cr（Ⅵ）下，菌体长度普遍在3～5 μm；在175 mg/L Cr（Ⅵ）下，菌体的平均长度甚至可以达到5～7 μm.相较于胁迫前的菌体，在含Cr（Ⅵ）环境下生长的菌体长度明显变长.但KL01菌体表面始终保持光滑，未见吸附有块状物.结合EDS分析（图6），无论KL01在20 mg/L还是100 mg/L Cr（Ⅵ）下，菌体表面的铬原子百分比均小于0.05（表1），说明KL01表面不吸附Cr（Ⅵ）.

3.6 Cr（Ⅵ）胁迫后KL01的TEM - EDS Mapping检测

在175 mg/L的Cr（Ⅵ）环境下培养后，对KL01进行了TEM观察及TEM-EDS Mapping检测.TEM观察图像见图7，高Cr（Ⅵ）胁迫后KL01部分菌体破裂，内容物流出.完整菌体内部胞质部分可见清晰黑点，分布较均匀，经TEM-EDS Mapping后据Cliff Lorimer进行定量分析，发现菌体内部含有少量铬（表2），据Mapping图像（图8）可见这些铬均匀分布于胞质中，未在胞壁或质膜上集中分布.

3.7 KL01去除Cr（Ⅵ）能力

KL在驯化前后的除Cr（Ⅵ）能力如图所示图9a，在驯化前，KL01在2 d内对Cr（Ⅵ）的去除量为96.09%.经驯化后，KL01在2 d内对Cr（Ⅵ）的去除量为96.55%，除Cr（Ⅵ）效率有所提高.而KL01对于更高浓度的Cr（Ⅵ）时的处理效果并不理想，在40 mg/L时去除率仅有46%左右（图9b）.

3.8 不同因素对KL01除Cr（Ⅵ）的影响

3.8.1 温度对KL01除Cr（Ⅵ）的影响 温度对KL01除Cr（Ⅵ）的影响如图10a，选择了与KL01最适生长温度30 ℃及附近的25 ℃和35 ℃进行实验.发现在30 ℃时KL01的除Cr（Ⅵ）效果最好，提高或降低培养温度至25 ℃和35 ℃时，KL01对Cr（Ⅵ）的去除效果均大幅降低.

3.8.2 pH对KL01除Cr（Ⅵ）的影响 如图10b所示，pH对于KL01除Cr（Ⅵ）的影响较小.在pH为7.5时除Cr（Ⅵ）效果最好，在pH小于等于7.0或大于等于8.0的情况下，KL01对Cr（Ⅵ）的去除效果稍差.在pH 9.0的环境下KL01对Cr（Ⅵ）的还原率仍可达88.28%，说明KL01具有在偏碱环境下除Cr（Ⅵ）的能力.

3.8.3 盐浓度对KL01除Cr（Ⅵ）的影响 以KL01能够生存的4%至14%的盐浓度设计了实验，盐浓度对于KL01还原Cr（Ⅵ）的影响见图10c.在KL01的最适生长盐浓度6%下，对Cr（Ⅵ）的去除效果最好，为97.51%.随体系内盐浓度增加，KL01的除Cr（Ⅵ）率逐渐降低，盐浓度在4%和8%时对Cr（Ⅵ）的去除率分别为85.44%和88.28%，说明KL01具有在高盐环境下仍然具有一定的除Cr（Ⅵ）的能力.但在更高的盐浓度下，KL01的除铬能力已低于80%，受到严重影响.

4 讨 论

本研究从实验室中分离到了一株耐盐Cr（Ⅵ）还原菌Oceanobacillus picturae KL01，其最高可耐受200 mg/L Cr（Ⅵ）和16%的盐浓度，具有良好的耐Cr（Ⅵ）及耐盐能力.驯化后的KL01能在48 h内其最适生长条件（6%盐浓度）下，对20 mg/L Cr（Ⅵ）的还原率在96%以上，能够在高NaCl浓度下的有氧环境中去除Cr（Ⅵ）.使用SEM对KL01在高浓度Cr（Ⅵ）环境下胁迫后的菌体进行观察发现KL01菌体表面无块状吸附物，且菌体长度明显变长.在菌体长度增加这点上，与假单胞杆菌G1DM21（Pseudomonas sp.G1DM21）在Cr（Ⅵ）环境下培养后的观察到的变化一致［18］，表现为阻滞细胞正常的生长周期，干扰了正常的细胞分裂［19］，说明了高浓度Cr（Ⅵ）对于细胞的毒性.由SEM-EDS可检测到无论在高浓度还是低浓度的Cr（Ⅵ）环境下，KL01菌体表面均无铬的存在，不进行体外吸附.通过TEM观察了KL01胁迫后的内部情况，发现胞质部分可见均匀分布的黑点，经TEM-EDS Mapping进一步检测后确定为胞内吸附的少量铬.同时，还使用单因素法考察了不同环境因素对于KL01还原Cr（Ⅵ）的影响，发现其在30 ℃，pH 7.5，盐浓度6%时，具有较好的除Cr（Ⅵ）效果.温度对于其Cr（Ⅵ）还原能力影响较大，在25 ℃和35 ℃下的除Cr（Ⅵ）率较30℃时大幅降低.盐浓度在4%～8%时，KL01对Cr（Ⅵ）的去除率维持在85%以上，在高盐浓度下仍然能很好的去除体系中的Cr（Ⅵ）.而这正好对应着目前很大一部分高盐含Cr（Ⅵ）废水的盐浓度［20， 21］，体现了其应用在工业废水除Cr（Ⅵ）中的优势.pH对于KL01的Cr（Ⅵ）还原效果影响并无其他因素大，在pH 6.5～8.5下均有较好的效果，这意味着KL01在有氧条件下盐碱环境中也能很好地发挥其功能.

综上所述，本文分离得到了一株Cr（Ⅵ）还原菌KL01，对高无机盐及高Cr（Ⅵ）环境具有耐受性，能在有氧、高盐浓度、中性偏碱环境下对Cr（Ⅵ）进行还原，为微生物处理高盐含Cr（Ⅵ）废水的研究提供了理论依据.

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