慢性乙型肝炎与HBV相关慢加急性肝衰竭患者血浆外泌体差异miRNA的生物信息学分析

张舒阳　毕研贞　刘守胜　柳盛　辛永宁

摘要：目的探討慢性乙型肝炎（CHB）患者与HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）患者血浆外泌体microRNA（miRNA）表达谱差异，分析其功能及生物学过程，以期获得可用于HBV-ACLF临床诊断的参考依据。方法选取2021年10月—2022年6月青岛市市立医院感染科住院的6例CHB患者及青岛市第六人民医院血液净化中心接受治疗的6例HBV-ACLF患者。运用Illumina高通量测序技术对这些患者的血浆外泌体miRNA进行检测，筛选差异miRNA并进行功能富集分析，分析其参与的生物学过程。检测得到的外泌体差异miRNA以倍数上调＞2倍或下调＞2倍且P＜0.05为标准筛选。计量资料两组间比较采用Mann－Whitney U秩和检验。计数资料两组间比较采用χ2检验。结果筛选差异miRNA共249种，与CHB组相比，HBV-ACLF组上调miRNA 126种，下调miRNA 123种。生物信息学分析结果显示，这些差异表达miRNA主要参与了性腺发育、调控蛋白质稳定性、细胞对外界刺激反应等生物学过程，并与乙型肝炎、蛋白多糖在癌症中的作用、调节干细胞多能性、MAPK、Hippo、TNF、脂质代谢等信号通路密切相关。结论通过Illumina高通量测序技术筛选出的差异miRNA可能作为HBV-ACLF早期诊断及预后判断的生物标志物。

关键词：乙型肝炎， 慢性； 慢加急性肝功能衰竭； 外泌体； 微RNAs

基金项目：国家自然科学基金（82202416）；北京肝胆相照公益基金会人工肝专项基金（RGGJJ-2021-030）

Differentially expressed microRNAs in plasma exosomes from patients with chronic hepatitis B or hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure： A bioinformatics analysis

ZHANG ShuyangBI Yanzhen LIU Shousheng LIU Sheng XIN Yongning（1. Qingdao Clinical Medical College of Nanjing Medical University， Qingdao， Shandong 266011， China; 2. Department of Infectious Diseases， Qingdao Municipal Hospital， Qingdao， Shandong 266011， China; 3. Clinical Research Center， Qingdao Municipal Hospital， Qingdao， Shandong 266071， China; 4. Department of Blood Purification， Qingdao Sixth Peoples Hospital， Qingdao， Shandong 266033， China）

Corresponding authors：XIN Yongning， xinyongning@163.com （ORCID：0000-0002-3692-7655）; LIU Sheng， lius123@163.com （ORCID：0000-0002-9485-0211）

Abstract：ObjectiveTo investigate the differences in plasma exosomal microRNA （miRNA） expression profile between patients with chronic hepatitis B （CHB） and those with hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure （HBV-ACLF）， as well as their functions and biological processes， and to provide a reference for the clinical diagnosis of HBV-ACLF. MethodsSix patients with CHB who were hospitalized in Department of Infectious Diseases， Qingdao Municipal Hospital， and six patients with HBV-ACLF who were treated in Blood Purification Center of Qingdao Sixth Peoples Hospital from October 2021 to June 2022 were enrolled. Illumina high-throughput sequencing was used to analyze the plasma exosomal miRNAs of these patients to obtain the differentially expressed miRNAs between the two groups. The differentially expressed miRNAs were screened， and a functional enrichment analysis was performed to identify the biological processes involving such miRNAs. The Mann-Whitney U rank sum test was used for comparison of continuous data between two groups， and the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups. ResultsA total of 249 differentially expressed exosomal miRNAs were obtained according to the criteria of upregulation >2-fold or downregulation >2-fold， with P<0.05， and compared with the CHB group， there were 126 upregulated miRNAs and 123 downregulated miRNAs. The bioinformatics analysis showed that these differentially expressed miRNAs were mainly involved in the biological processes such as gonadal development， regulation of protein stability， and cellular response to external stimuli， and they were closely associated with the signaling pathways such as hepatitis B， the role of proteoglycans in cancer， regulation of stem cell pluripotency， MAPK， Hippo， TNF， and lipid metabolism. ConclusionThe differentially expressed miRNAs identified by Illumina high-throughput sequencing may be used as biomarkers for the early diagnosis and prognostic evaluation of HBV-ACLF.

Key words：Hepatitis B， Chronic； Acute-On-Chronic Liver Failure； Exosomes； MicroRNAs

Research funding：National Natural Science Foundation of China（82202416）; Special Fund for Artificial Liver of Beijing Public Welfare Foundation（RGGJJ-2021-030）

据估计，中国HBV感染者占总人口的5%～6%，而感染者中有2 000万～3 000万例慢性乙型肝炎（CHB）患者［1］。亚太和非洲地区肝脏疾病的主要病因即为HBV感染，HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）作为一种常见的复杂综合征，因其高病死率、预后差的特点而备受关注，但HBV-ACLF临床特征和发生发展机制尚不清楚［2］，如能早期诊断便可使患者及时接受强化管理，从而降低发病率和病死率。有资料［3］显示，外泌体中包含的miRNA在疾病状态下的改变使其可作为多种疾病的生物标志物，且在肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等方面已取得较大进展，因此本研究探索CHB与HBV-ACLF患者血浆外泌体源性的miRNA表达谱差异，通过生物信息学分析差异表达miRNA的功能和生物学过程，以探寻可能作为HBV-ACLF早期诊断及表征预后的生物标志物，并为进一步研究发病机制提供参考依据。

1资料与方法

1.1研究对象选取2021年10月—2022年6月青岛市市立医院感染科住院的CHB患者6例及青岛市第六人民医院血液净化中心接受治疗的HBV-ACLF患者6例，诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［4］及《肝衰竭诊治指南（2018年版）》［5］。排除标准：（1）未成年人及妊娠患者；（2）HBV以外其他病因所致的肝衰竭，如自身免疫性、酒精性、药物性及其他不明原因；（3）合并其他类型肝炎病毒感染；（4）合并恶性肿瘤或活动性消化道出血；（5）合并严重心、脑、肾脏疾病及其他系统性疾病。

1.2一般资料收集与标本采集及保存收集患者住院期间临床资料及肝病相关化验指标。采集CHB组及HBV-ACLF组研究对象空腹静脉血标本８ mL，于4    ℃下3 000 r/min离心10 min，上层淡黄色透明液体则为血浆，收集后分装到EP管中，于-80 ℃冰箱冷冻备用。

1.3血浆外泌体的提取、鉴定将500 μL血浆样本-80 ℃取出，25 ℃水浴解冻，13 000×g、4 ℃离心10 min；按照1∶1的样本体积加入Buffer XBP，样本与Buffer XBP混合液转移至 exoEasy spin column，500×g、4 ℃离心1 min，弃除底部废液；加入3.5 mL的Buffer XWP到 exoEasy spin column中，5 000×g、4 ℃离心5 min，弃除底部废液；转移spin column到新的收集管中，加入200 μL Buffer XE，5 000×g、4 ℃离心5 min收集底部外泌体到1.5 mL离心管中，将提取到的外泌体沉淀分装保存于-80 ℃冰箱。利用透射电镜检测外泌体的形态及大小，取外泌体样本5 μL滴加在铜网上，室温孵育并吸干多余液体后，于铜网上滴加一滴2%的乙酸双氧铀，室温干燥后上机观察。利用Western blot检测外泌体表面蛋白标志物CD63、CD81、TSG101的表达和内质网蛋白Calnexin的表达。利用纳米颗粒示踪分析（NTA）进行外泌体粒子检测，测定外泌体粒径大小。

1.4miRNA特异文库构建及测序分析应用TRIzol试剂提取外泌体总RNA，由上海华盈生物医药科技有限公司进行文库构建及测序分析。采用The QIAseq miRNA Library Kit试剂盒通过二代测序实现稳定的miRNA特异文库构建。通过Illumina高通量测序得到原始测序结果，使用软件Cutadapt（version 2.7）、perl5（version 26）完成数据质控，使用软件bowtie（version 1.3.0）将数据比对到miRBase数据库，最终完成miRNA定量。采用R包edgeR对2组间miRNA信息进行表达差异计算，以倍数上调＞2倍或下调＞2倍且P＜0.05为标准筛选差异miRNA。

1.5生物信息学分析使用miRTarBase数据库对差异表达的miRNA进行靶基因预测注释，通过Fisher精确检验，使用R包对得到的差异miRNA靶基因进行GO富集分析及KEGG通路富集分析。

1.6统计学方法应用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料以M（P25～P75）表示，两组间比较采用Mann－Whitney U秩和检验。计数资料两组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般资料12例患者一般情况见表１。两组患者间ALT、AST、TBil、DBil、PLT、PT、APTT比较差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。

2.2血浆外泌体分离鉴定及外泌体miRNA表达谱比较利用透射电镜、Western blot、NTA多层面鉴定外泌体。透射电镜下可见CHB与HBV-ACLF来源外泌体均为直径约100 nm左右的囊泡（图1）。Western blot可检测到膜蛋白CD63、CD81及膜结合蛋白TSG101的目的蛋白条带，而内质网蛋白Calnexin在外泌体样本中呈现阴性结果，符合外泌体的蛋白特征。外泌体粒子测定结果提示CHB及HBV-ACLF两组样本外泌体粒径峰值分别为127.1 nm及142.5 nm（图2），进一步提示提取物为外泌体。通过测序分析，确定miRNA差异表达谱，对得到的差异表达miRNA进行可视化（图3）。样本间差异表達miRNA的信号比值进行聚类（图4），按照筛选标准共筛选出差异表达miRNA 249种，其中上调miRNA 126种，下调miRNA 123种。上调和下调最显著的15种miRNA见表2。

2.3差异miRNA靶基因GO富集分析筛选出的249种差异表达miRNA主要参与染色质的共价修饰、分解代谢过程的正向调节、Ras蛋白信号转导等重要的生物学过程，同时还与黏着斑、转录调节复合体、位单元前沿、核斑点、有被小泡、泛素连接酶复合体、早期内体、液泡膜等细胞组成密切相关，并具有DNA结合转录激活子活性、RNA聚合酶 Ⅱ 特异性、泛素蛋白连接酶结合、转录共调节因子活性、转录共激活因子活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等分子功能（图5）。尤其是性腺发育、蛋白质稳定性的调节、细胞对外界刺激的反应等生物学过程与HBV-ACLF肝脏病变的进展密切相关，而细胞基质结、细胞器膜固有成分等细胞组成及分子功能的表达也共同参与肝细胞的损伤与再生。

2.4差异miRNA靶基因KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析结果显示这些靶基因涉及多种信号通路的调节（图6），包括蛋白质多糖在癌症中的作用、调节干细胞多能性、MAPK、细胞衰老、Hippo、TNF、脂质与动脉粥样硬化、乙型肝炎、内吞作用、轴突导向等信号通路。尤其是乙型肝炎信号通路，表明这些靶基因可能通过影响细胞存活、脂质代谢、T淋巴细胞凋亡、生长因子及细胞因子等参与HBV-ACLF的发生发展（附录A）。

3讨论

近年来，外泌体在细胞间信息传递中的作用得到了广泛认可。外泌体是大小为30～100 nm的双层膜结构的细胞外囊泡，广泛存在于包括血液、尿液、唾液等各种人体体液中，人体大多数细胞都可以产生外泌体，并参与免疫调节、细胞分化迁移、细胞间信号传导等不同的生理功能［6-8］。而它除了作为细胞间通信维持人体正常的生理功能外，在疾病状态下外泌体所包含成分的改变也使其作为各种疾病的生物标志物成为可能［6］。再加上外泌体具备作为生物标志物的所有特点［3］，因此目前已成为极大的研究热点并取得了很大进展。在所有外泌体包涵物中，蛋白质和miRNA是目前被认为最有潜力的生物标志物，也是被研究最多的外泌体生物标志物。有资料显示，相对于蛋白质来说，外泌体源性的miRNA特异性更强［7］，对于疾病的病理状态反应更早且更为灵敏［8］，更有潜力成为疾病的生物标志物。因此在本研究中选择探究外泌体源性的miRNA而非蛋白质，来寻找可能作为HBV-ACLF早期诊断和预后评估的生物标志物。

本研究利用CHB与HBV-ACLF患者的血液样本，分离血浆外泌体，运用Illumina 高通量测序进行miRNA表达谱分析，共筛选出249种外泌体差异表达miRNA，其中126种差异miRNA表现为上调，123种表现为下调。本研究结果提示CHB与HBV-ACLF患者血清中miRNA存在差异表达，有潜力成为HBV-ACLF早期诊断及判断预后的标志物。相关研究提供了类似证据，Chen等［9］采用全基因组芯片对一对同卵双胞胎（1名ACLF患者和1名HBV无症状携带者）外周血单个核细胞的miRNA表达谱进行比较，发现与HBV无症状携带者相比，ACLF患者hsa-let-7a和hsa-miR-16的表达上调均＞8倍，表明hsa-miR-16和hsa-let-7a可能促进ACLF的发展。

在HBV-ACLF组表达上调的miRNA中，miR-122作为肝细胞基因网络和通路的调节因子，在肝脏疾病的发生发展中发挥着重要作用［10-12］。例如肝细胞的分化［11］、调节胆固醇和脂肪酸代谢［12］等，已经成为有潜力的肝损伤生物标志物［13］。据研究［12］发现，miR-122在肝细胞癌（HCC）患者中的表达降低，通过局部引起肿瘤抑制基因Pten的下调，使得肿瘤起始细胞扩大，导致HCC的进展，并与HCC的不良预后和转移潜力有关，属于肝脏特异性肿瘤抑制因子［14］。也有研究［15］发现肝脏特异性miR-122通过与HCV基因组RNA的5′端非编码区直接相互作用，可促进HCV的复制，这表明miR-122可能是抗病毒干预的重要靶点。可见miR-122参与控制多种生物过程，包括细胞分化、发育和凋亡，甚至影响病毒的复制等，涉及多种肝脏疾病的发生发展。在乙型肝炎方面，过表达的miR-122可下调MAP3K2信号通路对乙型肝炎表面抗原的迁移和分泌产生抑制作用［16］，但Wen等［17］发现miR-122-3p的表达水平与HBV-ACLF患者肝脏炎症的严重程度呈正相关，其表达上调可能导致HBV特异性T淋巴细胞功能受损并加强病毒持久性损伤，这有助于预测HBV-ACLF的严重程度，本研究与之相符的是，相较于CHB组，hsa-miR-122b-3p在HBV-ACLF组血浆中表达上调，但hsa-miR-122b-3p是否可以作为HBV-ACLF早期诊断的生物标志物，尚需做进一步的验证。Let-7是一个庞大而古老的miRNA家族，以牺牲再生为代价发挥肿瘤抑制作用，在肿瘤中表达下调［18-19］。另外有研究［20］表明，肝硬化患者血清中let-7a-5p水平降低，且与肝纤维化严重程度明显相关，其机制可能是通过肝星状细胞中的TGF-β信号通路激活肝纤维化前过程。在肝衰竭方面，一项动物研究［21］发现，急性肝衰竭小鼠模型在加重至肝性脑病过程中由于TGF-β1信号通路的激活导致let-7f表达增加，并最终预后较差。这一发现与本研究中HBV-ACLF组血浆外泌体源性let-7b-3p呈高表达趋势一致，但是目前未见let-7b-3p与HBV-ACLF相关的研究报道，对于let-7b-3p是否可以作为HBV-ACLF患者预后判断的生物标志物，仍需进一步研究。

在HBV-ACLF组表达下调的miRNA中，miR-96与消化系统肿瘤及转移瘤的发生发展关系密切［22-24］。一项动物研究［23］表明，在二乙基亚硝胺诱导的大鼠HCC模型中，miR-96在HCC组显著上调，且研究［24］发现miR-96水平在肝脏原发性肿瘤到远处转移的过程中升高，说明miRNA-96可能在HCC的起始或进展中起作用。但Shi等［25］研究发现miR-96参与了葡萄籽原花青素提取物对高脂饮食诱导的小鼠模型血脂异常的调节过程，可能通过mTOR和FOXO1信号通路促进自噬通量以清除脂质积累，帮助调控体内血脂水平，减轻高脂饮食对肝脏的损伤，这对维持细胞稳态、保持器官功能和循环至关重要。ACLF患者病程中确实存在血脂代谢异常［26］，本研究首次在 HBV-ACLF 患者外泌體中检测到miR-96-3p表达下调，其表达下调是否影响血脂调控而进一步加重肝损伤，从而参与HBV- ACLF发病过程，仍需要进一步的实验验证。

综上所述，本研究通过对CHB与HBV-ACLF患者血浆外泌体源性的miRNA表达谱比较分析，筛选出249种差异miRNA，利用生物信息学分析，发现这些差异miRNA主要参与性腺发育、蛋白质稳定性的调节、细胞对外界刺激的反应等生物学过程，并与乙型肝炎、蛋白多糖在癌症中的作用、调节干细胞多能性、MAPK、Hippo、TNF、脂质代谢等信号通路密切相关。这为寻找HBV-ACLF早期诊断及表征预后的生物标志物并进一步探究发病机制提供了参考依据。

伦理学声明：本研究方案于2021年9月9日经由青岛市市立医院医学伦理委员会审批，批号：2021临审字Y第017号。所有研究对象已签署知情同意书。 利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。作者贡献声明：张舒阳负责查阅、归纳文献，资料分析，撰写论文；毕研贞、刘守胜负责修改论文；柳盛负责参与血液标本收集；辛永宁负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。

附录A见二维码

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收稿日期：2022-12-07；錄用日期：2023-01-17

本文编辑：林姣

引证本文：ZHANG SY， BI YZ， LIU SS， et al. Differentially expressed microRNAs in plasma exosomes from patients with chronic hepatitis B or hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure： A bioinformatics analysis［J］. J Clin Hepatol， 2023， 39（8）： 1848-1856.